[發明專利]一種溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法及其應用在審
| 申請號： | 201910064696.7 | 申請日： | 2019-01-23 |
| 公開（公告）號： | CN109884004A | 公開（公告）日： | 2019-06-14 |
| 發明（設計）人： | 馬江鋒;成超;姜岷 | 申請（專利權）人： | 南京工業大學 |
| 主分類號： | G01N21/64 | 分類號： | G01N21/64 |
| 代理公司： | 江蘇致邦律師事務所 32230 | 代理人： | 徐蓓 |
| 地址： | 211816 江蘇*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 單加氧酶 檢測 底物 輔酶 酶活 應用 辣根過氧化物酶 篩選 流式細胞儀 純化產物 電子供體 高效快速 過氧化氫 氧氣反應 熒光檢測 靈敏度 二羥基 規模化 試鹵靈 乙酰基 高酶 可用 通量 熒光 菌種 自動化 | ||
1.一種溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，其特征在于，底物10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪和輔酶辣根過氧化物酶混合，加入溶解性多糖單加氧酶后檢測熒光放射強度變化。
2.根據權利要求1所述的溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，其特征在于，具體包括如下步驟：
（1）將底物10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪和輔酶辣根過氧化物酶混合，采用PIPES緩沖溶液調節溶液的pH值；
（2）將不同濃度的溶解性多糖單加氧酶液分別加入到上述混合溶液中，在一定溫度條件下反應一段時間；在激發光560nm，發射光590nm條件下檢測熒光，以溶解性多糖單加氧酶的濃度為橫坐標，熒光增強速率為縱坐標作圖，繪制溶解性多糖單加氧酶酶活的標準曲線；
（3）按照步驟（1）、（2）將溶解性多糖單加氧酶粗酶液加入到10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪和輔酶辣根過氧化物酶混合液中，反應后檢測熒光，對照標準曲線計算粗酶液酶活。
3.根據權利要求1所述的溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，所述的步驟（1）中10-乙酰基-3,7-二羥基吩噁嗪的濃度為10μM，輔酶辣根過氧化物酶濃度為30U/ml，PIPES緩沖溶液濃度為100mM，所述pH值為6 .0。
4.根據權利要求1所述的溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，步驟（2）所述溶解性多糖單加氧酶酶液的濃度為0-20μg/mL。
5.根據權利要求1所述的溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，所述的步驟（2）中反應溫度為30℃，反應時間為30min。
6.根據權利要求1所述的溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，其特征在于，該方法檢測限1ug/ml。
7.根據權利要求1所述的溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法，其特征在于，向所述步驟(2)中加入抑制劑EDTA會抑制溶解性多糖單加氧酶的酶活。
8.權利要求1所述溶解性多糖單加氧酶酶活的檢測方法在溶解性多糖單加氧酶酶活檢測以及大規模篩選中的應用。
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