[發明專利]核型分析制備高分辨染色體分散液

有效

• 申請號: 201910061346.5
• 申請日: 2019-01-23
• 公開（公告）號: CN109540644B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 李存璽;劉恒濤;劉舒;李能干
• 申請（專利權）人: 北京仁基源醫學研究院有限公司;李存璽;劉恒濤
• 主分類號: G01N1/38
• 分類號: G01N1/38
• 代理公司: 北京中知法苑知識產權代理有限公司 11226
• 代理人: 常玉明;張蘭海

本發明涉及核型分析專用制備高分辨染色體分散液及其制備方法。核型分析專用制備高分辨染色體分散液，其特征在于：由以下組分組成：Tris?HCL 0.05～1mmol/L，pH為7.5～10.0；KCl 2～8g/L，溶劑為三蒸水。本發明核型分析專用制備高分辨染色體分散液對淋巴細胞染色體的鋪展分散效果非常好，尤其對高分辨和超高分辨染色體核型分析減少了染色體之間的交叉和重疊個數，極大地提高了分析染色體核型的質量。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及核型分析制備高分辨染色體分散液。

背景技術

染色體是基因的載體，正常人類細胞中共有23對46條染色體，其中22對44條為常染色體，另1對為2條性染色體。染色體可能發生數量和結構性改變，從而引起各種遺傳缺陷、先天性遺傳病、胚胎停育及自然流產、腫瘤等等。由染色體異常所引起的疾病一般被稱為染色體病。

染色體檢測目前在臨床中多用于生殖、婦產、新生兒、血液病、腫瘤等專業。使用細胞培養后染色體顯帶技術診斷遺傳病，雖然方法相對簡單，但仍然是產前診斷的金標準。正常結果是男性46,XY，女性46,XX，除此之外的結果均為異常的。

染色體核型分析主要分為細胞培養、收獲、制片、顯帶和分析幾個步驟。其中，在收獲細胞的過程中需要進行低滲處理，即利用水分子在半透膜間定向擴散的滲透現象，使細胞外的水分子不斷向細胞內擴散，從而達到使有核細胞膨脹的目的。早在1952年，美籍華裔學者徐道覺首次發現低濃度氯化鉀KCl溶液有助于染色體鋪展和辨別形態特征。而在這之前，由于技術限制，核型分析時染色體難以分散，導致學界長期普遍認為人類有48條染色體。由此可見低滲環節對染色體分散至關重要，關乎染色體核型分析的成敗。

現在制備染色體時普遍使用的0.075mol/L KCl(等價質量工作濃度為5.9g/L)低滲溶液已經60多年未變，但是對于高分辨和超高分辨染色體的鋪展分散并不理想，分散差會使染色體交叉、疊壓或纏繞在一起，難以辨別染色體，降低分析工作效率，甚至導致分析染色體核型失敗。盡管Ohnuki在1968采用岡氏分散液處理細胞，對細胞染色體鋪展有一定的幫助，其副作用是姐妹染色體長臂及短臂容易分開，且條帶模糊不清，染色體的條帶辨認困難，核型分析失敗的幾率非常高。

為了優化染色體的分散度，在CN 103308361 B專利中，細胞低滲30分鐘。在CN103710434 B和CN 103710435 B專利里，0.075mol/L KCl溶液低滲細胞20-30分鐘。一是低滲時間較長；二是低滲300-400每套單倍體條帶數目(Bands Per Haploid Set，BPHS)，低于高分辨的染色體，效果可以，因染色體較短，容易分開。但是對高分辨或超高分辨染色體，較長的染色體分散效果非常差，染色體纏繞疊壓在一起，很難分辨染色體，容易導致發染色體報告失敗。至于低滲時間，Ikeuchi在文獻中報道0.075mol/L KCl低滲細胞，30分鐘。張清健等認為0.075mol/L KCl溶液低滲時間定為40分鐘為最佳條件。低滲液處理細胞時間的長短對染色體結構及顯帶效果影響非常大，處理時間超過20分鐘或太長，將導致姐妹染色單體分離比例明顯增加(Ikeuchi，2004)，且很難觀察到染色體的詳細帶紋。本發明目的在于開發一種專門用于制備高分辨染色體的分散液，既可減少染色體的交叉重疊纏繞，又避免人為造成姐妹染色單體分離影響顯帶分析。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了核型分析制備高分辨染色體分散液，本發明的分散液無論化學成分、理化特性和使用方法均與傳統的低滲液不同。我們在研發過程中反復試驗了EGTA、HEPES、Tris-EDTA、氯化銨、六偏磷酸鈉和Tris-HCl等溶液。最終選擇了Tris-HCl緩沖液做為基礎液最佳，外周血淋巴細胞高分辨染色體鋪展及分散效果最好，也使得顯微鏡下高分辨染色體的形態特征清晰可辨。與傳統的0.075mol/L KCl低滲液相比，大大減少染色體的交叉重疊率。有效地提高了高分辨染色體質量和工作的效率。

本發明的目的之一是提供一種核型分析制備高分辨染色體分散液。