[發(fā)明專利]非洲豬流感病毒DNA連接酶的晶體及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910060493.0
• 申請(qǐng)日: 2019-01-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109810955A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 甘建華;李繼喜;陳屹勍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/00
• 分類號(hào): C12N9/00;G16C20/50
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種非洲豬流感病毒DNA連接酶的晶體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明DNA連接酶AsfvLIG含419個(gè)氨基酸，分子量約為45kDa；在表達(dá)菌株Escherichia coli BL21(DE3)中具有高度可溶性表達(dá)。通過(guò)X射線衍射的方法獲得了其三維結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到2.5?。一個(gè)晶體學(xué)不對(duì)稱單位中有一個(gè)蛋白分子，由9個(gè)α螺旋以及17個(gè)β折疊組成；同時(shí)結(jié)合其催化反應(yīng)底物DNA。該結(jié)構(gòu)中第153位天冬酰胺、第211位亮氨酸、第402亮氨酸和第403谷氨酰胺具有與人源DNA連接酶不同的構(gòu)象。該DNA連接酶AsfvLIG的晶體結(jié)構(gòu)可在針對(duì)非洲豬瘟病毒藥物設(shè)計(jì)或藥物篩選中具有廣泛的用途。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及來(lái)源于非洲豬流感病毒Asfivirus屬中DNA連接酶AsfvLIG表達(dá)純化、晶體生長(zhǎng)方法、晶體結(jié)構(gòu)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬流感病毒（African swine fever virus, ASFV）是一種雙鏈DNA病毒，歸屬于Asfivirus屬，并且是目前僅知的Asfarviridae家族病毒。ASFV病毒的傳染性非常強(qiáng)，既能感染野生豬，也能感染家豬。ASFV病毒的潛伏期非常短，有些情況下兩天左右便會(huì)出現(xiàn)病癥。非洲豬流感的早期癥狀包括發(fā)熱、厭食、四肢泛力等，這些同正常的豬流感的癥狀很相似，因此早期非洲豬流感常被誤診為正常的豬流感。后期的時(shí)候，感染ASFV的豬會(huì)出現(xiàn)體溫下降、皮膚發(fā)紅等與正常豬流感不同的癥狀，但此時(shí)豬的淋巴結(jié)、腎臟、胃腸粘膜等部位已明顯出血，并會(huì)迅速死亡。

中國(guó)、美國(guó)以及聯(lián)合國(guó)衛(wèi)生部們?cè)趦?nèi)的多個(gè)國(guó)家和組織開(kāi)展了很多合作研究。但是，目前還沒(méi)有任何有效的ASFV病毒檢測(cè)手段和疫苗被研發(fā)出來(lái)，大規(guī)模屠宰和焚燒受感染的豬仍是控制ASFV病毒漫延的最主要手段。ASFV病毒是已報(bào)道的最復(fù)雜的DNA病毒之一，其基因組全長(zhǎng)在170-190kb之間，編碼了150-170種不同的蛋白。這些蛋白參與了ASFV病毒生命循環(huán)的多個(gè)過(guò)程，包括基因表達(dá)、DNA復(fù)制、病毒顆粒組裝、宿主細(xì)胞侵染以及宿主免疫應(yīng)答的抑制等。同正常的豬流感病毒相比，ASFV病毒基因組的突變頻率要高很多。僅通過(guò)對(duì)其中一個(gè)基因B6464L的3’-端序列測(cè)定，就有20多個(gè)不同的ASFV基因型被鑒定出來(lái)。這些不同基因型的形成使得ASFV疾病的癥狀、診斷和預(yù)防都變得更加困難。

ASFV病毒可以在豬的多種不同細(xì)胞中復(fù)制，其中單核巨噬細(xì)胞是ASFV病毒最主要的宿主細(xì)胞。雖然ASFV病毒的DNA合成起始于細(xì)胞核，但其主要的DNA合成以及病毒顆粒組裝的過(guò)程則是在細(xì)胞質(zhì)中完成的。巨噬細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)為富氧環(huán)境，其中氧自由基的含量很高。這些高濃度氧自由基的存在對(duì)ASFV病毒的基因組造成了持續(xù)不斷的損傷，導(dǎo)致了ASFVDNA鏈的斷裂以及堿基脫嘌呤環(huán)等。為了有效地對(duì)抗這類DNA損傷，ASFV基因組編碼了三個(gè)DNA修復(fù)蛋白（包括DNA剪切酶AsfvAP, DNA合成酶AsfvPolX以及DNA連接酶AsfvLIG），構(gòu)成了一條完整的Base excision repair (BER) 修復(fù)通路。其中AsfvAP負(fù)責(zé)將脫嘌呤的堿基（dF）從DNA鏈上剪切掉，形成缺口；AsfvPolX則負(fù)責(zé)將缺失的DNA補(bǔ)充完整；在ATP的參與下，AsfvLIG將DNA骨架上的缺口連接起來(lái)，完成修復(fù)過(guò)程。