[發明專利]非洲豬流感病毒DNA連接酶的晶體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201910060493.0
• 申請日: 2019-01-22
• 公開（公告）號: CN109810955A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 甘建華;李繼喜;陳屹勍
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;G16C20/50
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

1. 一種非洲豬流感病毒DNA連接酶AsfvLIG的晶體，其特征在于，參數為：

晶體空間群：P2₁

晶胞參數：a=72.257 ?，b=55.159 ?，c=79.875 ?，α=γ=90°，β=103.15°。

2.根據權利要求1所述的晶體，其特征在于，晶體三維結構中，一個晶體學不對稱單位中有一個蛋白分子，由9個α螺旋以及17個β折疊組成。

3.根據權利要求2所述的晶體，其特征在于，所述的晶體三維結構具體組成如下：α螺旋1，即含有Asn3-Gln4，β折疊1，即含有Gln8-Ser10，β折疊2，即含有Ile13-Cys15，β折疊3，即含有Ile19-Thr23，β折疊4，即含有Gly26-Val38，：α螺旋2，即含有Asp48-Ser52，β折疊5，即含有Val59-Val68，β折疊6，即含有Thr79-Val81，α螺旋3，即含有Val95-Ala111，β折疊6，即含有Ile147-Lys151，β折疊6，即含有Ile155-Lys170，α螺旋4，即含有Asp181-Phe191，β折疊7，即含有Tyr199-Tyr205，α螺旋5，即含有Leu211-Asn219，β折疊8，即含有His228-Phe235，α螺旋6，即含有Ser244-Gln257，β折疊9，即含有Ile266-Gln269，α螺旋7，即含有Val275-Glu288，β折疊10，即含有Glu291-Arg296，β折疊11，即含有Leu314-Leu317，β折疊12，即含有Leu321-Gln332，β折疊13，即含有Ile342-Leu348，β折疊14，即含有Lys351-Lys359，α螺旋8，即含有Tyr363-Lys372，α螺旋9，即含有Pro375-Leu382，β折疊15，即含有Gly384-Ser395，β折疊16，即含有Gly399-Leu402，β折疊17，即含有Arg405-Phe409。

4.根據權利要求1-3之一所述的晶體，其特征在于，所述的DNA連接酶AsfvLIG的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

5.一種如權利要求1-4之一所述的非洲豬流感病毒DNA連接酶AsfvLIG的晶體的制備方法，具體步驟為：

（1）將預先制備好的高純度AsfvLIG蛋白濃縮至0.4-0.6mM, 并加入等體積的對應的濃度為0.4-0.6mM的DNA底物，所述DNA底物含有三條DNA鏈，其序列分別為SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4；

（2）使用商業化結晶試劑盒作為晶體生長的初篩條件，用座滴氣象擴散法進行結晶，通過優化調整，最終在0.05-0.5M的醋酸銨，pH為4-6、濃度為0.1-0.3M 的BIS-TRIS，5-18%的分子量為100-10000的PEG分子條件下，得到衍射分辨率高的晶體。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟（1）中所述非洲豬流感病毒DNA連接酶AsfvLIG的蛋白純度在90%以上。

7.如權利要求1所述的非洲豬流感病毒DNA連接酶AsfvLIG的晶體結構在藥物設計、制備或藥物篩選中的用途。

8. 根據權利要求7所述的用途，其特征在于， AsfvLIG 的NTD結構域以及催化位點：N153、L211、L402、Q403附近的口袋都是AsfvLIG特異性的，作為理想的藥物設計靶點，用于設計針對非洲豬瘟病毒的小分子藥物與篩選大分子抗體。