[發(fā)明專(zhuān)利]一種毛細(xì)血管畸形相關(guān)多基因的捕獲測(cè)序方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910058369.0
• 申請(qǐng)日: 2019-01-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109777857A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉贇;蔡韌
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 寧波愛(ài)她基因科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12Q1/6883
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種毛細(xì)血管畸形相關(guān)多基因的捕獲測(cè)序方法，該方法至少包括如下步驟：基因組DNA的提取和片段化，片段化DNA末端補(bǔ)平、接頭連接、捕獲前PCR、雜交捕獲、捕獲后PCR。本發(fā)明選取的與人毛細(xì)管畸形相關(guān)的多個(gè)基因，包括ACVRL1、AKT1、ENG、EPHB4、GNA11、GNAQ、KRAS、MAP2K1、NRAS、PIK3CA、PTEN、RASA1、SMAD4、TEK，通過(guò)將基因捕獲技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，從而檢測(cè)靶基因的所有變異類(lèi)型，如突變、缺失、插入、融合等。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種毛細(xì)血管畸形相關(guān)多基因的捕獲測(cè)序方法。

背景技術(shù)

毛細(xì)血管畸形為新生兒易患疾病，其中包括多個(gè)亞型，僅葡萄酒色斑（鮮紅斑痣）罹患率就高達(dá)千分之三，而這些疾病跟基因突變有著密不可分的關(guān)系。在《血管瘤和脈管畸形診斷和治療指南（2016版）》中明確提出多個(gè)分型跟基因突變的關(guān)系。其中與動(dòng)靜脈畸形相關(guān)的基因多達(dá)十幾個(gè)，且存在臨床診斷、用藥選擇困難。

為解決以上問(wèn)題，我們通過(guò)基因捕獲的高通量測(cè)序方法將很好的解決此類(lèi)問(wèn)題。

目標(biāo)序列的富集可以通過(guò)兩種策略來(lái)實(shí)現(xiàn)：捕獲或擴(kuò)增。目前的許多技術(shù)大多是采用這兩種模式，有時(shí)是將它們相結(jié)合。

捕獲法通常是從NGS的文庫(kù)制備開(kāi)始的，比如打斷DNA，將接頭與片段連接，并開(kāi)展PCR擴(kuò)增。之后，使用與感興趣的片段互補(bǔ)的生物素化探針，讓其與DNA雜交，再用鏈霉親和素篩出。通過(guò)第二輪PCR釋放互補(bǔ)鏈，然后就可以測(cè)序了。

目標(biāo)序列的富集也可以利用多重PCR的策略來(lái)開(kāi)展，這稱(chēng)為擴(kuò)增子方法。將DNA酶切消化，利用探針來(lái)捕獲兩端以形成環(huán)狀的DNA模板，或使用基因組或隨機(jī)剪切的DNA模板。之后，利用特異性引物來(lái)擴(kuò)增感興趣的DNA區(qū)域，形成高度富集的DNA庫(kù)。

高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性的改變，一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，因此在有些文獻(xiàn)中稱(chēng)其為下一代測(cè)序技術(shù)(next generationsequencing，NGS)足見(jiàn)其劃時(shí)代的改變，同時(shí)高通量測(cè)序使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，所以又被稱(chēng)為深度測(cè)序(deep sequencing)。

通過(guò)將基因捕獲技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，我們可以對(duì)毛細(xì)血管畸形相關(guān)的14個(gè)基因進(jìn)行全面的突變?cè)u(píng)估。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明旨在提供一種多探針富集毛細(xì)血管畸形相關(guān)14個(gè)基因靶區(qū)域的方法，通過(guò)設(shè)計(jì)專(zhuān)用的捕獲探針庫(kù)，采用探針捕獲技術(shù)一次性富集多個(gè)基因多靶點(diǎn)序列，從而實(shí)現(xiàn)多基因多靶點(diǎn)并行深度高通量測(cè)序。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種基于多探針富集14個(gè)基因靶區(qū)域的方法，包括如下步驟。

S1 基因組DNA的提取和片段化。

1.1 準(zhǔn)備試劑如下：QIAamp DNAMini試劑盒。

1.2 基因組DNA的提取，用QIAamp DNAMini試劑盒對(duì)被檢者進(jìn)行組織提取，被檢者組織的取材應(yīng)取自表皮以下的真皮層，包含毛細(xì)血管為宜。

1.3 基因組DNA片段化，使用Covaris儀器，并按推薦操作流程進(jìn)行操作，目標(biāo)片段大小為200-300bp。

S2 片段化DNA末端補(bǔ)平。

2.1 準(zhǔn)備試劑如下：End prep mix4。

2.2 配制反應(yīng)體系：在PCR管中加入DNA和End prep mix4，配制完成后，渦旋并短暫離心。

2.3 將配制完成的反應(yīng)體系置于PCR儀上，啟動(dòng)反應(yīng)程序。