[發(fā)明專利]一種毛細血管畸形相關(guān)多基因的捕獲測序方法

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• 申請日: 2019-01-22
• 公開（公告）號: CN109777857A
• 公開（公告）日: 2019-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉贇;蔡韌
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波愛她基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12Q1/6883
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種毛細血管畸形相關(guān)多基因的捕獲測序方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1 基因組DNA的提取和片段化

1.1 準備試劑如下：QIAamp DNAMini試劑盒；

1.2 基因組DNA的提取，用QIAamp DNAMini試劑盒對被檢者進行組織提取，被檢者組織的取材應取自表皮以下的真皮層，包含毛細血管為宜；

1.3 基因組DNA片段化，使用Covaris儀器，并按推薦操作流程進行操作，目標片段大小為200-300bp；

S2 片段化DNA末端補平

2.1 準備試劑如下：End prep mix4；

2.2 配制反應體系：在PCR管中加入DNA和End prep mix4，配制完成后，渦旋并短暫離心；

2.3 將配制完成的反應體系置于PCR儀上，啟動反應程序；

S3 接頭連接

3.1 準備試劑如下：Rapid Ligation Buffer2、Rapid DNA Ligase、DNA Adaptor X、高純水、80%乙醇、AHTS DNA Clean Beads；

3.2 配制反應體系：在PCR管中加入模板、Rapid Ligation Buffer2、Rapid DNALigase、DNA Adaptor X、高純水，配制完成后，渦旋并短暫離心；

3.3 將配制完成的反應體系置于PCR儀上，啟動反應程序；

3.4 連接產(chǎn)物純化

3.4.1 加80μL磁珠到上步產(chǎn)物中，輕輕吹打10次以保證整個體系均勻；室溫孵育5分鐘，使文庫結(jié)合到磁珠上；

3.4.2 離心管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體；

3.4.3 保持離心管在磁力架上，待溶液澄清（約5分鐘）后，小心棄去上清，注意不要擾動磁珠；

3.4.4 保持離心管在磁力架上，沿著管壁緩慢加入200μL新鮮配制的80%乙醇，注意加入乙醇時不要擾動磁珠，孵育30秒后小心移除上清；

3.4.5 重復步驟3.4.4，共漂洗兩次；

3.4.6 用2-10μL移液器吸走所有殘留乙醇；開蓋在空氣中干燥3-5分鐘；

3.4.7 加入22.5μL 滅菌水混勻后靜置5分鐘；

3.4.8 離心管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體；

3.4.9 保持離心管在磁力架上，待溶液澄清（約5分鐘）后，將20μL上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL的離心管中；

S4 捕獲前PCR

4.1 準備試劑如下：PCR Primer mix2、Amplification mix3、80%乙醇、AHTS DNAClean Beads；

4.2 配制反應體系：在PCR管中加入模板、PCR Primer mix2、Amplification mix3，配制完成后，渦旋并短暫離心；

4.3 將配制完成的反應體系置于PCR儀上，啟動反應程序；

4.4 捕獲前PCR產(chǎn)物純化

4.4.1 加45μL磁珠到上步產(chǎn)物中，輕輕吹打10次以保證整個體系均勻；室溫孵育5分鐘，使文庫結(jié)合到磁珠上；

4.4.2 離心管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體；

4.4.3 保持離心管在磁力架上，待溶液澄清（約5分鐘）后，小心棄去上清，注意不要擾動磁珠；

4.4.4 保持離心管在磁力架上，沿著管壁緩慢加入200μL新鮮配制的80%乙醇，注意加入乙醇時不要擾動磁珠，孵育30秒后小心移除上清；

4.4.5 重復步驟4.4.4，共漂洗兩次；

4.4.6 用2-10μL移液器吸走所有殘留乙醇；開蓋在空氣中干燥3-5分鐘；

4.4.7 磁珠晾干后，將離心管從磁力架上取下，加入22.5μL水覆蓋磁珠，使用移液器吹打混勻磁珠；

4.4.8 室溫孵育2分鐘；如果磁珠干燥開裂，適當延長孵育時間；

4.4.9 將離心管短暫離心后置于磁力架中，分離磁珠和液體直到溶液澄清（約5分鐘）；若少量的磁珠不再吸附在磁力架上，用移液器在上清中吹打混勻未吸附的磁珠，使其重新懸浮，繼續(xù)孵育直至沒有磁珠殘留在上清中；

4.4.10 小心吸取21μL上清轉(zhuǎn)移至相應編號的新的小PCR管中；

4.4.11 進行Qubit定量；

S5 雜交捕獲

5.1 準備試劑如下：探針、Cot-1 DNA、XGen universal Blockers-Tsmix、2×Hybridization Buffer、Hybridization Buffer Enhancer、Nuclease-free water、2×Bead wash Buffer、10×wash Buffer I、10×wash Buffer II、10×wash Buffer III、10×stringent wash Buffer、Streptavidin Beads 270、PCR Primer Mix2、AmplificationMix3、80%乙醇、AHTS DNA Clean Beads；

5.2 配制反應體系：在PCR管中加入Pool barcoded library、Cot-1 DNA、XGenuniversal Blockers-Tsmix、配制完成后，渦旋并短暫離心；

5.3 將上步溶液在抽真空儀里45℃抽干35分鐘；

5.4 配制雜交反應體系：在抽干的PCR管中加入2×Hybridization Buffer、Hybridization Buffer Enhancer、Nuclease-free water，配制完成后，先室溫放置5分鐘，吹打后再室溫靜置5分鐘；然后將反應體系置于PCR儀中，95℃，10分鐘；結(jié)束后，立刻拿出放在事先準備好的冰盒上，靜置2分鐘；立即加入4μL XGen lockdown probe pool，快速吹打混勻10秒，短暫離心，終體積為17μL；65℃，過夜（至少4小時）；

需要說明的是，采用IDT Inc合成探針，探針區(qū)域見附表1；

5.5 雜交后處理：準備1x工作液，包括Bead wash Buffer、wash Buffer I、washBuffer II、wash Buffer III、stringent wash Buffer；在室溫平衡Streptavidin Beads270 30分鐘，充分振蕩混勻Streptavidin Beads 270 15秒；在1.5mL管子中加100μLStreptavidin Beads 270，將管子放在磁力架上，Beads分層，棄去上清；加入200μL1×Beadwash Buffer，渦旋10秒，放回磁力架，分層，棄去上清；再次加入200μL1×Bead washBuffer，渦旋10秒，放回磁力架，分層，棄去上清；加入100μL1×Bead wash Buffer，振蕩；將重懸的100μL Beads加到0.2mLPCR管，放到磁力架，棄去上清，立即進入下一步；

5.6 將雜交產(chǎn)物結(jié)合到Streptavidin Beads 270上：將處理后的雜交產(chǎn)物放入有Beads的0.2mLPCR管中，吹打混勻10次；金屬浴65℃（75℃）,45分鐘；每隔15分鐘，渦旋3秒，2500rpm；

5.7 洗滌磁珠，棄除未結(jié)合的DNA：加入100μL1×Wash Buffer I到上步產(chǎn)物的管子中，短暫渦旋后轉(zhuǎn)移至1.5mL管子中，將管子放在磁力架上，棄去上清；加入200μL1×stringentwash Buffer上下吹打10次；金屬浴65℃，5分鐘；放到磁力架上，棄去上清；再次加入200μL1×stringent wash Buffer上下吹打10次；金屬浴65℃，5分鐘；放到磁力架上，棄去上清；RT洗：加入200μL1×wash Buffer I，渦旋2分鐘，放到磁力架，棄去上清；加入200μL1×washBuffer II，渦旋1分鐘，放到磁力架，棄去上清；加入200μL1×wash Buffer III，渦旋30秒，放到磁力架，棄去上清；重懸Beads，從磁力架上拿下EP管，加入20μLNuclease-free water（后帶Beads做PCR），上下吹打10次；

S6 捕獲后PCR：

6.1 準備試劑如下：PCR Primer Mix2、Amplification Mix3、80%乙醇、AHTS DNAClean Beads；

6.2 配制反應體系：在PCR管中加入模板，PCR Primer Mix2、Amplification Mix3，配制完成后，渦旋并短暫離心；

6.3 將配制完成的反應體系置于PCR儀上，啟動反應程序；

6.4 擴增后產(chǎn)物進行Qubit定量；

6.5 捕獲后PCR產(chǎn)物純化

6.5.1 渦旋磁珠使其充分混勻，各加75μL磁珠到上面的產(chǎn)物中，輕輕吹打10次以保證整個體系均勻；室溫孵育5分鐘，使文庫結(jié)合到磁珠上；

6.5.2 離心管短暫離心并置于磁力架上分離磁珠和液體；

6.5.3 保持離心管在磁力架上，待溶液澄清（約5分鐘）后，小心棄去上清，注意不要擾動磁珠；

6.5.4 保持離心管在磁力架上，沿著管壁緩慢加入200μL新鮮配制的80%乙醇，注意加入乙醇時不要擾動磁珠，孵育30秒后小心移除上清；

6.5.5 重復步驟6.5.4，共漂洗兩次；

6.5.6 用2-10μL移液器吸走所有殘留乙醇；開蓋在空氣中干燥3-5分鐘；

6.5.7 磁珠晾干后，將離心管從磁力架上取下，加入22μL IDTE覆蓋磁珠，使用移液器吹打混勻磁珠；

6.5.8 室溫孵育2分鐘；如果磁珠干燥開裂，適當延長孵育時間；

6.5.9 將離心管短暫離心后置于磁力架中，分離磁珠和液體直到溶液澄清（約5分鐘）；若少量的磁珠不再吸附在磁力架上，用移液器在上清中吹打混勻未吸附的磁珠，使其重新懸浮，繼續(xù)孵育直至沒有磁珠殘留在上清中；

6.5.10 小心吸取20μL上清轉(zhuǎn)移至相應編號的新的1.5mL離心管中，進行Qubit定量；

6.5.11 雜交捕獲后產(chǎn)物可以在-80℃長期保存，等待最終上機測序。