[發(fā)明專利]用于肺癌檢測的DNA甲基化qPCR試劑盒及使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910054201.2
• 申請日: 2019-01-21
• 公開（公告）號: CN109504780B
• 公開（公告）日: 2021-09-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓艷;霍華德;萬季;王志強;余濤;張超;張劍;宋麒
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市新合生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京冠和權(quán)律師事務(wù)所 11399
• 代理人: 朱健;陳國軍

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和DNA檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于肺癌檢測的DNA甲基化qPCR試劑盒及其使用方法，具體而言，涉及一種利用血漿游離DNA進行甲基化qPCR以確定一個或多個基因靶點(例如SHOX2、HOXA9和TAC1)的甲基化狀態(tài)來用于肺癌檢測或篩查的試劑盒及其使用方法，經(jīng)實驗測試，本發(fā)明試劑盒可將生物標(biāo)記物的檢測靈敏度提高到皮克/納克級DNA分子，檢測靈敏度的提高是通過優(yōu)化特定核苷酸序列引物及DNA探針以及改進血漿游離DNA的亞硫酸氫鹽處理方法來實現(xiàn)的。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和DNA檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于肺癌檢測的DNA甲基化qPCR試劑盒及其使用方法，具體而言，涉及一種利用血漿游離DNA進行甲基化qPCR以確定一個或多個基因靶點(例如SHOX2、HOXA9和TAC1)的甲基化狀態(tài)來用于肺癌檢測或篩查的試劑盒及其使用方法，此外，本發(fā)明還涉及上述檢測試劑盒在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

肺癌是全世界范圍內(nèi)的主要死亡原因之一。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，2018年僅在美國就有大約234030例新發(fā)肺癌病例和154050例肺癌死亡病例，估計肺癌死亡人數(shù)大約相當(dāng)于結(jié)腸癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病和非霍奇金淋巴瘤死亡人數(shù)的總和。

目前針對肺癌的治療，早期診斷的非轉(zhuǎn)移性腫瘤多采用手術(shù)和放射療法，后期癌癥采用化學(xué)療法和放射療法的組合，更晚期或終末期癌癥則采用化學(xué)療法結(jié)合靶向療法。臨床數(shù)據(jù)顯示，I-II期肺癌患者的5年總生存率為30-49％，而III期及以后則為1-14％。由此可見，早期發(fā)現(xiàn)及時治療對肺癌患者的預(yù)后及生存期具有重要的影響，然而目前的臨床現(xiàn)實是，由于受到診斷手段的限制，大多數(shù)患者在晚期才被診斷出來，從而喪失了最佳的治療窗口。

臨床中肺癌的初步診斷和分期主要通過CT掃描對肺結(jié)節(jié)進行判斷，而進一步的細胞和分子表型診斷則必須通過細針抽吸或胸腔鏡等侵入性方法予以實施，因此，利用微創(chuàng)方法輔助早期診斷在臨床上有著極為廣闊的應(yīng)用前景。

DNA甲基化改變是癌癥進程中最早發(fā)生的分子變化之一，腫瘤抑制基因的高甲基化水平已被確定為抑制基因表達和促進癌細胞生長和擴增的重要機制。在眾多基因中，CpGs的高甲基化，特別是在SHOX2，TAC1和HOXA9中，已被認為是肺癌的生物標(biāo)志物，因此，對這些基因中的一種或多種的甲基化狀態(tài)進行分析可用于診斷肺癌的狀態(tài)。

目前在早期檢測和篩查肺癌方面存在的主要挑戰(zhàn)在于取得檢測樣本組織所需實施的侵入性活檢方法。毫無疑問，液體活組織檢查是該問題理想的解決方案，其中用于分析的生物樣品可以從血液、尿液、唾液、痰液或組織樣品獲得。

與傳統(tǒng)的癌癥診斷方法相比，液體活檢具有以下優(yōu)勢：

1.易取得，液體活檢樣本可從尿液、唾液和胸腔積液中獲得；

2.比傳統(tǒng)的腫瘤活組織檢查更少侵入性；

3.能取樣所有可能的癌細胞，而非僅局限于腫瘤活檢的某部分；

4.便于早期發(fā)現(xiàn)癌癥；

5.能用于監(jiān)測腫瘤動態(tài)(治療前、治療間和治療后)；

6.具有能作為理想識別標(biāo)靶治療因子的潛力。

人類生物樣本包含，源自所有組織(包括癌組織)的細胞、蛋白質(zhì)、外來體和游離DNA(cfDNA)、游離RNA(cfRNA)。其中，游離DNA的濃度非常低，在血漿中約為1-10ng/mL。腫瘤突變DNA可以在來自癌癥患者的生物樣本的cfDNA中檢測到，被稱為循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由單鏈或雙鏈DNA以及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，以DNA蛋白質(zhì)復(fù)合物或游離DNA兩種形式存在，這些ctDNA多為大約134-144bp的DNA片段，其濃度小于cfDNA。