[發(fā)明專(zhuān)利]一種基于選擇性消除野生鏈背景干擾的基因突變檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910052680.4
• 申請(qǐng)日: 2019-01-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109680044B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙美萍;陳維;陽(yáng)彝棟;肖先金;李夢(mèng)圓
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 代理公司: 北京萬(wàn)象新悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

本發(fā)明公開(kāi)了一種基于選擇性消除野生鏈背景干擾的基因突變檢測(cè)方法。通過(guò)PCR對(duì)待測(cè)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)Lambda核酸外切酶處理成單鏈DNA；設(shè)計(jì)并合成與野生型DNA序列目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的硫代DNA鏈以及與非目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的RNA封閉鏈，與單鏈DNA混合并升溫退火后加入DNase I進(jìn)行切割；DNase I在硫代DNA鏈的引導(dǎo)下選擇性地切除野生型DNA鏈目標(biāo)區(qū)域序列，突變型DNA鏈由于目標(biāo)區(qū)域內(nèi)存在錯(cuò)配不能被DNase I切除而得以保留，從而顯著提升突變型DNA鏈的豐度，大幅度降低了目前已有技術(shù)檢測(cè)低豐度基因突變的難度。本發(fā)明方法無(wú)需復(fù)雜昂貴的儀器，容易操作，成本低，1天之內(nèi)即可給出結(jié)果，可為臨床腫瘤早篩和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)提供及時(shí)、可靠的基因突變信息。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因組樣品處理和基因突變檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種對(duì)基因組樣品進(jìn)行預(yù)處理的方法，通過(guò)該方法消除野生型DNA后，與常規(guī)測(cè)序法聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)超低豐度基因突變的快速、低成本測(cè)序分析。

背景技術(shù)

癌癥(惡性腫瘤)是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的頭號(hào)殺手，與癌癥相關(guān)的早期診斷和術(shù)后復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)具有重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義。基因突變是指基因組DNA分子發(fā)生了可遺傳的變異現(xiàn)象，是導(dǎo)致惡性腫瘤形成的重要原因之一。傳統(tǒng)的腫瘤基因檢測(cè)手段主要是組織活檢，即通過(guò)手術(shù)穿刺的方式獲取腫瘤組織樣本并對(duì)其進(jìn)行基因檢測(cè)，該方法主要針對(duì)癌變組織進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于還未形成病灶的早期腫瘤細(xì)胞無(wú)法實(shí)現(xiàn)有效的檢測(cè)，對(duì)于已經(jīng)形成病灶的腫瘤組織也可能因?yàn)槟[瘤異質(zhì)性而得到假陰性的檢測(cè)結(jié)果。此外，這種侵入式的檢測(cè)手段給患者帶來(lái)較大的痛苦，且可能在手術(shù)穿刺時(shí)進(jìn)一步刺激癌組織引發(fā)惡化。組織活檢也不適合進(jìn)行連續(xù)取樣和病情跟蹤檢測(cè)。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療概念的提出和循環(huán)腫瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)¹、循環(huán)腫瘤細(xì)胞和外泌體等新型腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，液體活檢逐漸成為癌癥早期診斷的新希望。ctDNA是早期腫瘤細(xì)胞脫落或者凋亡后釋放至循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的DNA，該DNA高度碎片化但攜帶腫瘤細(xì)胞的全部基因突變信息。針對(duì)循環(huán)體系內(nèi)ctDNA的檢測(cè)能夠?yàn)槟[瘤早篩和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)提供重要的信息。由于正常細(xì)胞在程序性凋亡的過(guò)程中也會(huì)向循環(huán)系統(tǒng)中釋放大量的碎片化DNA，給血漿游離DNA(Cell free DNA，cfDNA)中ctDNA的檢測(cè)帶來(lái)很大程度的背景干擾。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，血漿中存在基因突變的ctDNA豐度一般在0.001％-10％之間，這對(duì)突變檢測(cè)方法的靈敏度和選擇性都提出了很高的要求。