[發明專利]一種基于選擇性消除野生鏈背景干擾的基因突變檢測方法

有效

• 申請號: 201910052680.4
• 申請日: 2019-01-21
• 公開（公告）號: CN109680044B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 趙美萍;陳維;陽彝棟;肖先金;李夢圓
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

1.一種非疾病診斷目的的基因突變檢測方法，包括以下步驟：

1）確定基因組DNA待測目標序列，該目標序列包括目標區域和非目標區域，設計并合成與野生型DNA序列目標區域互補的硫代DNA鏈以及與非目標區域互補的RNA封閉鏈，其中所述待測目標序列上可能存在突變位點的目標區域位于待測目標序列的中部，目標區域的長度控制在其熔解溫度Tm在42~46°C之間；

2）對待測目標序列進行PCR擴增，利用Lambda核酸外切酶將擴增產物處理成單鏈；

3）將步驟2）得到的單鏈DNA與步驟1）合成的硫代DNA鏈和RNA封閉鏈在DNase I緩沖溶液中混合，升溫退火后在50 μL體系中加入0.05U DNase I反應一段時間，熱失活DNase I；

4）對步驟3）酶切產物進行測序檢測。

2.如權利要求1所述的基因突變檢測方法，其特征在于，步驟1）中所述待測目標序列的長度為115~130 nt。

3.如權利要求1所述的基因突變檢測方法，其特征在于，目標區域的長度為 11~13 nt。

4.如權利要求1所述的基因突變檢測方法，其特征在于，步驟1）中所述非目標區域位于目標區域的兩端，與非目標區域互補的RNA封閉鏈為多條，每條長度為25~90 nt。

5.如權利要求1所述的基因突變檢測方法，其特征在于，所述硫代DNA鏈的長度為16~59nt，包括與野生型DNA目標區域互補片段和兩端的非互補片段。

6.如權利要求1所述的基因突變檢測方法，其特征在于，所述硫代DNA鏈為全硫代DNA鏈。

7.如權利要求1所述的基因突變檢測方法，其特征在于，步驟2）中PCR擴增采用的正向引物為5’-OH末端，反向引物的5’末端磷酸化標記，Lambda核酸外切酶選擇性地消化雙鏈DNA的5’磷酸化的鏈。

8.如權利要求1所述的基因突變檢測方法，其特征在于，步驟2）中PCR擴增產物經Lambda核酸外切酶處理成單鏈后通過超濾純化。

9.如權利要求1所述的基因突變檢測方法，其特征在于，步驟3）將步驟2）得到的單鏈DNA與步驟1）合成的硫代DNA鏈和RNA封閉鏈在DNase I緩沖溶液中混合，升溫退火后加入DNase I，在37~42°C溫度下反應30~45 min，然后熱失活DNase I。