[發明專利]一種基于分子動力學的酶柔性分析提高肝素酶I熱穩定性的突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 201910052220.1
• 申請日: 2019-01-21
• 公開（公告）號: CN109666666B
• 公開（公告）日: 2021-03-05
• 發明（設計）人: 羅學剛;張川;張同存;劉耀天
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/527;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發明涉及一種基于分子動力學的酶柔性分析提高肝素酶I熱穩定性的突變體，所述突變體為突變體BtHepI^Q198R和/或突變體BtHepI^K247W，所述突變體BtHepI^Q198R的氨基酸序列為SEQ ID NO.1，所述突變體BtHepI^K247W的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。本發明突變體為熱穩定性能優良的肝素酶I突變株，具有較大的工業應用潛力以及經濟價值，同時熱穩定性的肝素酶I對延長肝素酶I的貨架周期，提高其在催化工藝中的操作穩定性和重復利用批次，降低生產成本等，具有重要的意義。

技術領域

本發明屬于基因工程和蛋白質表達技術領域，尤其是一種基于分子動力學的酶柔性分析提高肝素酶I熱穩定性的突變體及其制備方法。

背景技術

肝素酶I(GenBank:AAO79780.1)是一類能夠裂解肝素類結構物質、制備低分子肝素的多糖裂解酶，來源比較廣泛，主要存在于原核生物肝素黃桿菌中，還包括一些擬桿菌和芽孢桿菌等。肝素酶I首先發現于肝素黃桿菌(Pedobacter heparinus)，可選擇性地剪切硫酸化肝素聚糖中葡萄糖胺和糖醛酸之間α(1-4)糖苷鍵。根據肝素酶I的各個來源的氨基酸序列以及蛋白結構特點，肝素酶I被劃分為糖苷水解酶PLs的13家族。目前肝素酶I主要應用于低分子肝素的制備、體外循環中肝素的消除、肝素確切結構的解析、以及在體外診斷試劑方面用于凝血試驗和血小板實驗。它在制備低分子量肝素、清除體外血液循環中肝素和確定肝素精細結構方面有著重要作用。當前對于肝素酶I的研究大都來自于肝素黃桿菌，本研究研究的是來源于多形擬桿菌的肝素酶I，但基于理性設計的肝素酶I的分子改造，尤其是關于肝素酶I熱穩定性的分子改造研究未見有報道。

目前市面上報道的肝素酶I的熱穩定性都很差，這一大弊端，嚴重地限制了肝素酶I在工業上的應用。篩選出熱穩定性肝素酶I的突變體，有助于優化肝素酶I降解肝素的生產工藝；此外，對于延長肝素酶I的貨架周期，也具有很重要的意義。傳統的定性進化方法工作量太大，無法在短時間內得到效果良好的突變體。

通過檢索，發現如下一篇與本發明專利申請相關的專利公開文獻：

一種提高肝素酶I活性的工程菌株構建方法(CN106497897A)，涉及一種高活性的肝素酶I及其高效可溶性基因工程表達生產方法。依照肝素酶I的空間結構分析對其氨基酸序列進行優化，獲得比酶活提高48％的Hep169。然后根據密碼子偏愛性優化HepI169基因，通過人工合成獲得基因DNA，克隆到表達載體中與SUMO等標簽進行融合表達，轉化宿主細胞、篩選建立了Hep169的可溶性基因工程表達生產體系，分析結果顯示目的蛋白獲得了高效的可溶性表達，且具有很好的生物學活性，能高效的裂解肝素生成低分子量肝素。本發明方法不僅提供了一種高活性的HepI，而且為肝素酶I的高效可溶性基因工程表達生產提供了一種新方法，可有效降低低分子肝素等藥物的生產成本，具有廣泛的應用前景。

通過對比，本發明申請與上述專利公開文獻存在本質的不同。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種基于分子動力學的酶柔性分析提高肝素酶I熱穩定性的突變體及其制備方法，該為熱穩定性能優良的肝素酶I突變株，與野生型相比，陽性突變體BtHepI^Q198R和BtHepI^K247W在40℃的半衰期較野生型BtHepI分別提高了30.55％和14.63％；在50℃下的半衰期較野生型BtHepI分別提高了61.04％和30.84％，具有較大的工業應用潛力以及經濟價值，同時熱穩定性的肝素酶I對延長肝素酶I的貨架周期，提高其在催化工藝中的操作穩定性和重復利用批次，降低生產成本等，具有重要的意義。

本發明解決其技術問題是采取以下技術方案實現的：