[發明專利]一種基于分子動力學的酶柔性分析提高肝素酶I熱穩定性的突變體及其制備方法

有效

• 申請號: 201910052220.1
• 申請日: 2019-01-21
• 公開（公告）號: CN109666666B
• 公開（公告）日: 2021-03-05
• 發明（設計）人: 羅學剛;張川;張同存;劉耀天
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/527;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

1.一種熱穩定性提高的肝素酶I 突變體，其特征在于：所述突變體為突變體BtHepI^Q198R和/或突變體BtHepI^K247W，所述突變體BtHepI^Q198R的氨基酸序列為SEQ ID NO.1，所述突變體BtHepI^K247W的氨基酸序列為SEQ ID NO.2。

2.一種如權利要求1所述的熱穩定性提高的肝素酶I 突變體的編碼基因，其特征在于：所述突變體BtHepI^Q198R的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3，所述突變體BtHepI^K247W的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.4。

3.包含如權利要求書2所述的編碼基因的重組質粒。

4.包含如權利要求書2所述的編碼基因的轉化子。

5.一種如權利要求1所述的熱穩定性提高的肝素酶I 突變體的制備方法，其特征在于：步驟如下：

利用定點突變技術，向野生型肝素酶I基因BtHepI中引入突變；測序驗證正確后，轉化大腸桿菌Rosetta（DE3）；經誘導表達并分離純化出熱穩定性提高的突變體。

6.一種如權利要求1所述的熱穩定性提高的肝素酶I 突變體的活性測定方法，其特征在于：步驟如下：

以肝素鈉為底物測定肝素酶I的活性，反應體系為：1.5 mL 的離心管中加入100 μL的底物緩沖液，所述底物緩沖液為50 mmol/L 醋酸鈉，5 mmol/L 醋酸鈣，5 mmol/L 肝素鈉的混合液，金屬浴中40 ℃恒溫孵育10 min，加入純化后濃度為20-25ug/ml的酶液10 μL，反應10 min，立即加入0.06 mol/L 鹽酸1 mL終止反應；在12000 r/min 條件下離心5 min，取上清液測定其在232 nm的吸光值。