[發明專利]雙受體時間分辨時間分辨熒光共振能量轉移法

在審

• 申請號: 201910048682.6
• 申請日: 2013-02-06
• 公開（公告）號: CN110044855A
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: P.羅比;B.伯恩德;S.達漢
• 申請（專利權）人: 珀金埃爾默生物信號股份有限公司
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 余曉文

本發明提供了使用雙受體時間分辨性熒光共振能量轉移法確定樣品中是否存在多種分析物的方法。

本申請是國際申請日為2013年02月6日的申請號為201380015407.5的中國發明專利申請“雙受體時間分辨時間分辨熒光共振能量轉移法”的分案申請。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2012年2月6日提交的第61/595,459號美國申請的權益，這里通過引用將其全部內容整體并入本文。

技術領域

本發明涉及利用時間分辨熒光共振能量轉移法(time-resolved fluorescenceresonance energy transfer)確定樣品中是否存在一種或多種分析物的多重測定。

背景技術

時間分辨熒光共振能量轉移法(TR-FRET)應用是基于給體(donor)和受體(acceptor)分子之間的能量傳遞。FRET是從熒光給體分子至合適的受體分子的非輻射能量轉移。如果緊鄰受體分子且給體分子的發射光譜和受體分子的激發光譜重疊，那么給體分子能夠使其激發能量轉移至受體分子，而不是發射熒光。接著，受體分析會在受體發射波長下發射熒光。出現受體發射波長的熒光表明給體和受體分子彼此緊鄰，給體和受體分子需要相隔小于約20nm，例如相隔5～10nm，以發生能量轉移。通常，通過生物親和性相互作用，例如蛋白質-蛋白質結合、抗原-抗體結合、配體-受體結合、DNA雜交和DNA-蛋白質結合，實現給體和受體分子的緊密靠近。

存在多種給體和受體分子。通常，用于FRET測定中的給體和受體分子是具有短半衰期的熒光基團。通過來自樣品組分例如緩沖液、蛋白質、化合物和細胞溶胞產物的背景熒光能夠降低常規FRET化學的性能。必須校正這種自熒光(auto-fluorescence)的檢測后的熒光強度，該自熒光降低測定靈敏度，并且能夠使結果翻譯復雜化。這種類型的背景熒光是短暫的(具有納秒范圍內的壽命)，并且因此使用時間分辨方法能夠加以消除。

TR-FRET利用鑭系元素的離子例如銪(Eu)、鋱(Tb)、釤(Sm)、鏑(Dy)的離子的特有性質。鑒于它們特定的光物理和光譜性質，稀土離子的絡合物對生物學中的熒光應用是感興趣的。具體地，當和更常見的熒光基團相比時，它們具有大的斯托克斯位移和長發射半衰期(從微秒至毫秒)。

通過直接激發產生鑭系元素離子的熒光是困難的，因為這些離子具有較差的吸光能力。鑭系元素必須首先和有機部分(organic moieties)絡合，該有機部分捕獲光并通過分子內的非輻射過程將光轉移至鑭系元素。稀土元素的螯合物和穴合物是集光部分的實例。所收集的能量被轉移至稀土離子，其然后發射它特有的長壽命熒光。鑭系元素螯合物常常也具有高量子產率，從而使少量給體產生光亮信號，因此提高了靈敏度。此外，它們的發射峰是相當窄的，從而對受體發射光的干擾很小。用于技術平臺的重要金屬中的一個是銪(在約315～350nm下激發，而在約600～635nm下發射)。

發明內容

本發明是至少部分基于TR-FRET的新方法。銪發射至少一種波長的能量。不計雜峰，它具有兩個主要的發射峰：一個峰在約600～635nm，而另一個在約675～715nm(圖1)。該觀測結果增大了具有兩個存在于TR-FRET測定中的受體分子的概率：將與600～635nm的發射峰相互作用的一個，和將與675～715nm的反射峰相互作用的一個。因此，一種鑭系元素螯合劑受體允許檢測樣品中的分析物或變體(modification)的兩種同時測定。