[發明專利]豬圓環病毒3型Cap重組蛋白及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201910046124.6
• 申請日: 2019-01-18
• 公開（公告）號: CN109762052B
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發明（設計）人: 白娟;李勇;姜辰龍;姜平;周而璇
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C12N15/34;C12N15/63;G01N33/68;C07K16/08
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 賈波

本發明公開了一種豬圓環病毒3型Cap重組蛋白及其編碼基因和應用，本發明采用PCR方法將PCV3 Cap基因中表達第1?120aa或60?120aa的基因片段刪除，得到了PCV3 Cap重組蛋白的編碼基因，將該編碼基因克隆至pET32a，再轉化至Rosseta感受態細胞，經IPTG誘導表達，可以得到PCV3 Cap重組蛋白。該蛋白呈可溶性表達，可與His標簽抗體結合，采用親和層析方法便于純化。采用該重組蛋白對豬進行免疫，可以得到多克隆抗體，該多克隆抗體效價高，與PCV3有相似的抗原性。以該重組蛋白包被酶標板，對PCV3進行間接ELISA抗體檢測，具有敏感性、特異性和重復性好等優勢。

技術領域

本發明涉及一種豬圓環病毒3型Cap重組蛋白及編碼該蛋白的基因，還涉及采用所得的豬圓環病毒3型Cap重組蛋白進行PCV3間接ELISA抗體檢測的應用。

背景技術

豬圓環病毒病由豬圓環病毒引起，豬圓環病毒(PCV)分為三個血清型，PCV1、PCV2以及PCV3。普遍認為PCV1對動物沒有致病性。目前，病毒感染特性和致病性研究最清楚的是PCV2，PCV2對養豬業造成的危害十分嚴重，可以引起圓環病毒相關疾病(PCVAD)，造成免疫抑制。PCV2主要有兩個閱讀框：ORF1和ORF2，ORF1表達Rep蛋白和剪切體Rep’，ORF2編碼病毒的Cap蛋白，Cap蛋白構成病毒核衣殼的主要成分，是病毒的主要結構蛋白，決定病毒的抗原性，還可以自我組裝形成病毒樣顆粒。ORF2基因是疫苗開發和病原檢測主要的靶蛋白，同時也是各亞型之間存在主要差異的基因。2016年美國學者Rachel Palinski等報道了一種新型病毒PCV3，隨后該病毒在亞洲、美洲、歐洲等很多國家和地區出現。PCV3基因組長2000bp，ORF1編碼Rep蛋白，長度297aa(氨基酸)，ORF2編碼Cap蛋白，長度214aa(氨基酸)。PCV3可以引起PDNS，并且表現出與PCV2類似的繁殖障礙、多系統性炎癥等癥狀。湛洋對PCV3Cap蛋白結構進行了分析，發現其與PCV2Cap蛋白結構不存在共同的線性表位。還有研究表明，PCV3ORF2基因和PCV2的ORF2基因表現出較大的差異，同源性僅37％左右，因此預測，PCV2疫苗對PCV3可能沒有交叉保護作用。

基于以上原因，目前PCV2疫苗以及PCV2的檢測方法都不能直接適用于PCV3，需要針對PCV3ORF2基因的特異性研究適合它的檢測方法和疫苗。臨床上常使用血清學監測的方法了解抗體或者病原在動物體內的分布情況。間接免疫熒光實驗和免疫過氧化物酶單層細胞試驗操作復雜，成本昂貴，對設備要求高，不適用于臨床大規模檢測。ELISA方法不僅可以簡便地對豬群感染情況進行監測，還可以用于評價疫苗的免疫效果，在ELISA方法中，包被抗原的濃度及純度是影響檢測結果敏感性和特異性的關鍵，因此研究PCV3Cap蛋白的可溶性表達及純化，得到適合于PCV3檢測的ELISA方法具有重要意義。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種豬圓環病毒3型Cap重組蛋白的編碼基因，該編碼基因是將PCV3ORF2(開放式閱讀框)基因的表達第1-120位氨基酸或第60-120位氨基酸的基因片段刪除后得到的，該基因成功實現了豬圓環病毒3型Cap重組蛋白的可溶性表達，即實現了PCV3Cap重組蛋白的可溶性表達。

PCV ORF2基因編碼Cap蛋白，Cap蛋白是該病毒的重要結構蛋白，決定了病毒的抗原性，是疫苗免疫靶向的主要抗原。大腸桿菌表達系統具有目的蛋白表達效率高、操作簡單、成本低等特點，其缺點是目的基因性質容易影響載體的表達，特別是目的基因的跨膜區、信號肽，可能使目的蛋白無法表達。本發明經過研究，通過將疏水性較強、抗原性較弱的PCV3ORF2基因的表達第1-120位氨基酸或第60-120位氨基酸的基因片段截短，實現了目的蛋白高效表達，而且，目的蛋白呈可溶性表達。目的蛋白基因的末端融合表達His標簽，可利于采用鎳柱親和層析純化目的蛋白。