[發(fā)明專利]一種錳過(guò)氧化氫酶在枯草芽孢桿菌表達(dá)體系構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910045910.4
• 申請(qǐng)日: 2019-01-18
• 公開（公告）號(hào): CN109486777B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李正強(qiáng);王明琦;曹新宇;張闖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/08
• 分類號(hào): C12N9/08;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

本發(fā)明提供了一種新的構(gòu)建錳過(guò)氧化氫酶枯草芽孢桿菌工程菌方法，使枯草芽孢桿菌yoqH?RIK1285?MnCAT分泌的嗜熱錳過(guò)氧化氫酶達(dá)到0.74mg/L，比現(xiàn)有技術(shù)常用的大腸桿菌表達(dá)體系提高了48%，且只有少量包涵體產(chǎn)生。同時(shí)，不需改變培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速等條件，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單；特別是整個(gè)表達(dá)過(guò)程中不需加入誘導(dǎo)劑IPTG，還能夠高效地分泌蛋白，極大地節(jié)約了發(fā)酵成本；具有積極的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種錳過(guò)氧化氫酶在枯草芽孢桿菌表達(dá)體系構(gòu)建方法，尤其是一種能分泌表達(dá)錳過(guò)氧化氫酶GWC的重組枯草芽孢桿菌工程菌yoqH-RIK1285-GWC的構(gòu)建方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

過(guò)氧化氫酶廣泛應(yīng)用于食品、紡織、造紙和醫(yī)藥等行業(yè)，尤其在紡織工業(yè)中，因?yàn)檫^(guò)氧化氫酶具有減少污染、提高后續(xù)印染質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛應(yīng)用。

已有文獻(xiàn)《從土芽孢桿菌屬sp. WCH70中提取的一種新的含六聚體錳過(guò)氧化氫酶》發(fā)現(xiàn)了一種新型錳過(guò)氧化氫酶GWC，但其將GWC在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)量低下僅為5mg/L（經(jīng)熱處理和鎳柱純化），且需要一種較為昂貴的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。這兩大劣勢(shì)限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種錳過(guò)氧化氫酶在枯草芽孢桿菌表達(dá)體系構(gòu)建方法，解決了現(xiàn)有構(gòu)建方法存在的表達(dá)產(chǎn)量低下僅為5mg/L，且需要一種較為昂貴的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的缺欠。

本發(fā)明所述的一種錳過(guò)氧化氫酶枯草芽孢桿菌工程菌的構(gòu)建，包括以下步驟：

1）以嗜熱菌Geobacillus sp. WCH70的基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增3’端含有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽的嗜熱錳過(guò)氧化氫酶GWC基因；PCR引物，包括上游引物和下游引物（其序?yàn)镾EQ ID 3、4）：

上游引物：5' GGAATTCCATATGTGGATTTATGAAAAAAAAT3'；

下游引物: 5' CCGCTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGAAAAATTTTATTGCGGT 3' ；

上游引物 5'端CATATG為NdeⅠ酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基GGAATTC；

下游引物5'端CTCGAG為XholⅠ酶切位點(diǎn)，保護(hù)堿基CCG；

2）將步驟1）得到的嗜熱錳過(guò)氧化氫GWC基因?yàn)镾EQ ID 1，酶切后與酶切后的穿梭質(zhì)粒pBE-S連接，得到重組穿梭質(zhì)粒pBE-S-GWC；

3）將步驟2）得到的重組穿梭質(zhì)粒pBE-S-GWC酶切后與信號(hào)肽文庫(kù)SP DNA-mix通過(guò)同源重組連接，得到質(zhì)粒文庫(kù)pBE-S-GWC-SP；

4）將質(zhì)粒文庫(kù)pBE-S-MnCAT-SP轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主RIK1285中，選取攜帶48種不同信號(hào)肽的重組菌株進(jìn)行表達(dá)，SDS—PAGE蛋白電泳圖見圖1，隨后篩選出蛋白分泌能力最高的重組枯草芽孢桿菌是由信號(hào)肽yoqH所協(xié)助，yoqH為SEQ ID 2，即得錳過(guò)氧化氫酶工程菌yoqH-RIK1285-GWC。

本發(fā)明的積極效果在于：提供了一種新的構(gòu)建錳過(guò)氧化氫酶枯草芽孢桿菌工程菌方法，使枯草芽孢桿菌yoqH-RIK1285-MnCAT分泌的嗜熱錳過(guò)氧化氫酶達(dá)到0.74mg/L，比現(xiàn)有技術(shù)常用的大腸桿菌表達(dá)體系提高了48%，且只有少量包涵體產(chǎn)生。同時(shí)，不需改變培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速等條件，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單；特別是整個(gè)表達(dá)過(guò)程中不需加入誘導(dǎo)劑IPTG，還能夠高效地分泌蛋白，極大地節(jié)約了發(fā)酵成本；具有積極的實(shí)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為攜帶48種不同信號(hào)肽的重組菌株表達(dá)錳過(guò)氧化氫酶SDS—PAGE蛋白電泳圖；

圖2為錳過(guò)氧化氫蛋白純化SDS-PAGE電泳圖。

具體實(shí)施方式