[發(fā)明專利]一種生物活性肽N14-Desacetoxytubulysin H的制備方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910045273.0
• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109678929A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳正治;龍伯華
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C07K5/117
• 分類號: C07K5/117;C07K1/16
• 代理公司: 北京華智則銘知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11573
• 代理人: 陳向敏

1.一種生物活性肽N¹⁴-Desacetoxytubulysin H的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、制備TUV片段(2)；

步驟2、制備生物活性肽N¹⁴-Desacetoxytubulysin H。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1中的制備TUV片段(2)具體為：

其合成路線為：

包括以下步驟：

步驟1.1、化合物10的合成：

首先按文獻(xiàn)(Macromolecules,2012,45(20):8172-8192)制得化合物9；

將化合物9溶于甲醇，加入苯甲醛，加熱回流反應(yīng)4h后，冰水浴冷卻到0℃，分批慢加硼氫化鈉，然后于室溫下攪拌反應(yīng)12h，減壓濃縮，加稀鹽酸淬滅反應(yīng)，再加氫氧化鈉水溶液堿化至溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮；

加入四氫呋喃/水混合溶劑，同時(shí)加入碳酸氫鈉，攪拌均勻后用冰水浴冷卻到0℃，緩慢滴加氯甲酸芐酯，30min后升到室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，減壓濃縮，加水稀釋，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到粗品，用洗脫液快速柱層析得化合物10；

步驟1.2、化合物11的合成：

將化合物10溶于DMSO，水浴冷卻下加入三乙胺和三氧化硫-吡啶復(fù)合物，于室溫下攪拌反應(yīng)3h后，加水淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用1M的KHSO₄溶液洗，水洗，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相加無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮抽干；

加入二氯甲烷，同時(shí)加入乙氧甲酰基亞甲基三苯基膦，于室溫下攪拌反應(yīng)10h后，減壓濃縮，得到粗品，用洗脫液快速柱層析得化合物11；

步驟1.3、化合物13的合成：

將化合物11溶于甲醇，冰水浴冷卻到0℃，加入六水合氯化鎳，攪拌均勻后分批緩慢加入硼氫化鈉，加畢繼續(xù)在0℃下反應(yīng)30min，加飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用水洗，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相加無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到中間體12；

將上述中間體12溶于無水四氫呋喃，冰水浴冷卻下加入硼氫化鈉和單質(zhì)碘，30分鐘后將溶液加熱回流反應(yīng)15h，冰水浴冷卻到0℃，加甲醇淬滅反應(yīng)，減壓濃縮，將殘余物溶于水，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相加無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到粗品，用洗脫液快速柱層析得化合物13；

步驟1.4、化合物14的合成：

將化合物13溶于無水二氯甲烷，加入PCC，于室溫下攪拌反應(yīng)4h后，過濾，濾液減壓濃縮，用第一淋洗劑快速柱層析；

加入二甲亞砜，同時(shí)加入亞硝基苯和L-脯氨酸，于室溫下攪拌反應(yīng)1h，冰水浴冷卻到0℃，加入甲醇和硼氫化鈉，攪拌反應(yīng)30分鐘后，加飽和碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相加無水硫酸鈉干燥，濾液減壓濃縮，用第二淋洗劑快速柱層析得到中間體13’；

將上述中間體13’溶于乙醇，加入冰醋酸和鋅粉，于室溫下攪拌反應(yīng)5h，加水稀釋，冰水浴冷卻到0℃，加氫氧化鈉固體堿化溶液的PH＝10，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相加無水硫酸鈉干燥，濾液減壓濃縮，用第三淋洗劑快速柱層析得到化合物14；

步驟1.5、化合物15的合成：將化合物14溶于無水DMF，加入咪唑和4-二甲氨基吡啶，冰水浴冷卻到0℃，加入叔丁基二甲基氯硅烷，30分鐘后恢復(fù)到室溫?cái)嚢璺磻?yīng)14h，加水淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用KHSO₄溶液洗兩次，水洗，飽和食鹽水洗滌兩次，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到粗品，用淋洗劑快速柱層析得化合物15；

步驟1.6、化合物17的合成：將化合物15溶于異丙醇，加入10％鈀碳催化劑，抽氣換氣三次，在氫氣球壓力下攪拌反應(yīng)4h，過濾，濾液減壓濃縮；

加入無水二氯甲烷，同時(shí)加入化合物16，EDCI以及HOBt，攪拌均勻后冷卻到0℃，滴加三乙胺，30分鐘后恢復(fù)到室溫?cái)嚢璺磻?yīng)20h，加水淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用水洗，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到粗品，用淋洗劑快速柱層析得化合物17；

步驟1.7、化合物18的合成：將化合物17溶于無水DMF，冰水浴冷卻到0℃，加入60％氫化鈉，攪拌反應(yīng)40分鐘后滴加碘甲烷，30分鐘后恢復(fù)到室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h，冰水浴冷卻到0℃，加飽和氯化銨水溶液淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用水洗，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到粗品，用淋洗劑快速柱層析得化合物18；

步驟1.8、化合物19的合成：將化合物18溶于無水甲醇，加入氟化銨固體，于室溫下攪拌反應(yīng)6h，然后加飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅反應(yīng)，二氯甲烷萃取三次，合并有機(jī)相用水洗，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，得到粗品，用淋洗劑快速柱層析得化合物19；

步驟1.9、化合物Tuv片段(2)的合成：將化合物19溶于無水乙腈，加入2-碘酰基苯甲酸IBX，加熱回流反應(yīng)1.5h，冷卻到室溫，過濾，濾液減壓濃縮，用第一淋洗劑快速柱層析；

加入無水甲醇，同時(shí)加入化合物20和三乙胺，于室溫下攪拌反應(yīng)15h，減壓濃縮，然后用第二淋洗劑快速柱層析；

加入無水乙腈，同時(shí)加入活性二氧化錳，將溶液加熱到60℃攪拌反應(yīng)20h，然后冷卻到室溫，滴加DBU，10分鐘再滴加三氯溴甲烷，于室溫下攪拌反應(yīng)4h，過濾，濾液減壓濃縮，用淋洗劑快速柱層析得到Tuv片段(2)。