[發(fā)明專利]人NF155抗原、人NF155抗體檢測試劑盒及其制備方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910043667.2
• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109810184B
• 公開（公告）日: 2022-07-12
• 發(fā)明（設計）人: 張崇珍;王穎;郝洪軍
• 申請（專利權）人: 武漢明德生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/70;G01N33/558
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 黃君軍

1.一種人NF155抗原的制備方法，其特征在于，所述人NF155抗原包括以下任意一種片段或者三種片段：

片段1：NF155-25，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

片段4：NF155-824，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

片段5：NF155-1048，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述人NF155抗原的制備過程包括如下步驟：

步驟1、將NF155-25、NF155-824、NF155-1048的3個片段的DNA序列分別進行基因合成，設計引物PCR擴增后，分別連接進表達載體，構建3個重組表達質(zhì)粒；

步驟2、將構建好的重組質(zhì)粒分別轉化進入表達菌，構建3個重組表達工程菌；

步驟3、NF155-25、NF155-824、NF155-1048的抗原片段的誘導表達及純化。

2.如權利要求1所述人NF155抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟1中所述5個片段的引物對分別為：

NF155-25-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

NF155-25-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

NF155-824-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

NF155-824-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

NF155-1048-P1：核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

NF155-1048-P2：核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

3.如權利要求1所述人NF155抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟1中PCR擴增的反應體系為：H₂O 38.7ul；Buffer 5ul；dNTP 3ul；上引物1ul；下引物1ul；DNA1ul；Taq E0.3ul；擴增程序為：94度變性5min；94度變性45sec、57度150sec、72度90sec，32個循環(huán)；72度延伸10min。

4.如權利要求1所述人NF155抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟3中誘導表達的具體步驟為：將3個重組菌分別接種于LB培養(yǎng)液中搖菌至OD600至0.6-0.8時，按1:1000加入24mg/ml濃度的IPTG誘導4-6小時；

所述步驟3中誘導表達后的純化條件是：上樣緩沖液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；或者上樣緩沖液：8M尿素、0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、10mM咪唑；結合緩沖液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、20mM咪唑；洗脫緩沖液：0.5M NaCl、20mM Na₂HPO₃、500mM咪唑。

5.一種人NF155抗原的表達載體，其特征在于，所述表達載體為3個，所述3個表達載體的表達區(qū)的核苷酸序列分別為：如SEQ ID NO.16、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20所示。

6.一種人NF155抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包括：

(A)包被有權利要求1所述的人NF155抗原的ELISA酶標板；所述的人NF155抗原包括NF155-25、NF155-824、NF155-1048中的任意一種或者三種；

(B)標準陰性血清：NF155抗體陰性的血清；

(C)標準陽性血清：NF155抗體陽性的血清；

(D)辣根過氧化物酶標記的酶標二抗：抗人IGG、IGM和IGA；

(E)樣品稀釋液、包被緩沖液、封閉液、ELISA酶標板洗滌液、抗體稀釋液、顯色液和終止液。

7.如權利要求6所述的人NF155抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述人NF155抗原中NF155-25，NF155-824和NF155-1048的包被濃度分別為200ng/ml、150ng/ml和250ng/ml。

8.一種人NF155抗體的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法包括以下步驟：

S1、制備檢測ELISA酶標板：包被緩沖液將權利要求1所述的人NF155抗原稀釋后加到酶標板中吸附，空干包被用洗液，加包被用封閉液封閉；所述的人NF155抗原包括NF155-25、NF155-824、NF155-1048中的任意一種或者三種；

S2、待檢血清、陰性血清、陽性血清分別作為一抗，加樣至ELISA酶標板孔中進行孵育；

S3、酶標二抗的孵育：辣根過氧化物酶標記的酶標二抗加入ELISA酶標板，洗滌液洗滌，甩干；

S4、加入顯色液，室溫避光孵育，加入終止液終止反應；在酶標儀上450nm波長下測定OD值；

所述檢測方法為非疾病的診斷和治療目的。