[發明專利]一種發根農桿菌介導的菠菜毛狀根遺傳轉化體系

有效

• 申請號: 201910041984.0
• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109762838B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 付春祥;戴紹軍;徐悅;曹英萍;王玉;李瑩
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所;上海師范大學;東北林業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/06;A01H6/02
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 梁正賢

一種發根農桿菌介導的菠菜毛狀根遺傳轉化的方法。主要包括使用發根農桿菌侵染菠菜外植體后產生毛狀根，再誘導菠菜毛狀根產生愈傷，通過愈傷分化，獲得菠菜毛狀根的再生株。此外，本發明實現了發根農桿菌的Ri質粒與攜帶外源基因的Ti質粒的共轉化，PCR結果和熒光顯微鏡觀察顯示,發根農桿菌Ri質粒的rol B基因以及Ti質粒中GFP基因已在菠菜毛狀根基因組中穩定表達。

技術領域

本發明屬于植物組培技術和植物轉基因技術領域，具體地涉及一種誘導菠菜(Spinacia oleracea)毛狀根及其培養和再生的方法。

背景技術

菠菜(Spinacia oleracea)屬雙子葉植物綱藜科菠菜屬，是以綠葉為主要器官的一年生或二年生草本植物。菠菜為綠葉蔬菜類中最主要的一種，具有較高的營養價值。由于菠菜耐寒性好，生長周期短，1年內可多茬栽培，是四季尤其是冬淡季主要供應的蔬菜之一。

近年來隨著人們對蔬菜的品質和營養價值等需求的日益提高，除了傳統育種之外，分子生物學技術手段也常被用來進行蔬菜的新品種培育或進行蔬菜功能基因的挖掘和鑒定。通過根癌農桿菌(Agrobacteriumtume faciens)里Ti質粒的T-DNA為媒介，將目的基因導入植物中，獲得外源基因穩定表達的轉基因株系，是研究植物基因功能和遺傳改良的主要技術手段之一。除了根癌農桿菌，在自然界中，發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)可通過Ri質粒的T-DNA，將誘導發根的基因位點rol基因(rol A、rol B和rolC)穩定整合到宿主植物基因組中，產生毛狀根。發根農桿菌也可以同時將Ri質粒中攜帶發根基因座的T-DNA和Ti質粒中攜帶外源基因的T-DNA共同整合到植物基因組中，實現共轉化。很多植物，如苜蓿(Medicago sativa)的毛狀根可以再生為具有正常育性的完整植株，這樣允許在整個植株水平評價外源基因的功能。因此，通過發根菌建立遺傳轉化體系，可以另辟蹊徑，作為植物遺傳轉化體系的另一選擇。

發根農桿菌侵染植物的效率較高，易得到毛狀根系。毛狀根具有生長速度快，遺傳穩定等特點，常用來作為很多重要研究的模型。例如番茄(Lycopersicon esculentum)的毛狀根和野生根的外部形態及內部結構非常相似，根特異性基因的表達在正常根和毛狀根中也無明顯差別，因此，番茄的毛狀根常被用來作為研究番茄根功能基因的一個模型。另外，部分植物能夠在超量吸收重金屬的同時保持正常生長代謝，如藜科植物菠菜根可以吸收重金屬鎘。相比于正常植物，毛狀根生長條件簡單可控，繁殖速度快，遺傳性能穩定，已經代替整個植株成為研究植物修復重金屬污染的重要模型之一。

鑒于毛狀根的重要性，很多植物毛狀根誘導及再生系統已經被建立，包括雪蓮(Saussurea involucrata)、五寸石竹(Dianthus chinensis)、北玄參(Scrophularia buergeriana)。然而，藜科植物的毛狀根體系的研究較為少見，目前僅有甜菜(Beta vulgaris)的毛狀根誘導成功的研究報道。本發明第一次誘導出了藜科蔬菜植物菠菜的毛狀根，并建立了菠菜毛狀根再生體系，在毛狀根里實現了Ti質粒共轉化。該系統可以用于菠菜基因功能的鑒定，并為今后菠菜的基因工程改良和分子育種提供輔助。

發明內容

本發明的目的是提供一種誘導菠菜毛狀根及其培養和再生的方法。利用本發明所述方法能夠高效快捷的誘導菠菜毛狀根，并且能得到菠菜毛狀根再生植株。