[發明專利]一種發根農桿菌介導的菠菜毛狀根遺傳轉化體系

有效

• 申請號: 201910041984.0
• 申請日: 2019-01-17
• 公開（公告）號: CN109762838B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 付春祥;戴紹軍;徐悅;曹英萍;王玉;李瑩
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所;上海師范大學;東北林業大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/06;A01H6/02
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 梁正賢

1.一種誘導菠菜毛狀根及其培養和再生的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟如下：

(1)活化農桿菌LBA9402，當菌液濃度OD 600值到達0.6到0.8之間時，離心富集菌體，后用液體侵染液重懸菌液至OD 600值等于0.3；液體侵染液的成分及終濃度為在SH基礎培養基中含有100μmol·L^-1乙酰丁香酮和15g·L^-1蔗糖；

(2)取20-35天的菠菜無菌苗的葉、葉柄和莖，將菠菜的無菌苗葉片剪成大小約5mm×5mm的小段，菠菜的葉柄和莖剪成長約為5mm小段，作為誘導菠菜毛狀根的外植體；

(3)將已經剪好的外植體置于侵染液中，振蕩孵育5分鐘后晾干，在共培養培養基上共培養2天，然后轉移到毛狀根培養培養基；所述共培養培養基的成分為在SH基礎培養基中含有終濃度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1瓊脂和100μmol·L^-1乙酰丁香酮；毛狀根培養培養基是在SH基礎培養基中含有終濃度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1瓊脂和300mg·L^-1特美汀；

(4)菠菜外植體產生毛狀根后，20-40天毛狀根能夠穩定增殖生長，每14天繼代一次；繼代培養基為在固體SH基礎培養基中含有終濃度15g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1瓊脂和300mg·L^-1特美汀；

(5)取處于穩定生長的菠菜毛狀根置于愈傷誘導培養基，20天繼代1次；所述愈傷誘導培養基是在SH基礎培養基中含有終濃度30g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1瓊脂、4mg·L^-12,4-二氯苯氧乙酸、1mg·L^-16-芐氨基嘌呤和300mg·L^-1特美汀；

(6)將毛狀根產生的愈傷用鑷子輕剝，繼代在分化培養基，在27℃下，光周期為8小時光照，16小時黑暗，培養30-40天；所述分化培養基是在SH基礎培養基中含有30g·L^-1蔗糖、7.8g·L^-1瓊脂、2mg·L^-16-芐氨基嘌呤和300mg·L^-1特美汀；

(7)將菠菜叢生芽分開，繼代在生根培養基上；在27℃下，光周期為8小時光照，16小時黑暗，培養10-20天直至菠菜生根；所述生根培養基是在1/2MS基本培養基中含有15g·L^-1蔗糖和7.8g·L^-1瓊脂。