[發明專利]一種誘變篩選高產3-羥基丙酸菌株的方法

在審

• 申請號: 201910040383.8
• 申請日: 2019-01-16
• 公開（公告）號: CN109852605A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 李文;王陶;朱蘊蘭;劉安倩
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N1/16;C12R1/72
• 代理公司: 合肥律眾知識產權代理有限公司 34147
• 代理人: 白凱園

本發明公開了一種誘變篩選高產3?羥基丙酸菌株的方法，包括步驟1、出發菌株的選擇：選用假絲酵母變種作為出發菌株；步驟2、菌株的活化；步驟3、菌株的多重誘變：氯化鋰誘變；紫外誘變；亞硝基胍誘變；步驟4、誘變菌株的篩選：將步驟3所得到的右邊之后的菌懸液分別梯度稀釋，取不同濃度的菌懸液200μL涂布至篩選培養基上，30?40℃培養48?72h，挑選透明圈與菌落直徑比值較大的單菌落進行保存；步驟5、誘變菌株的復篩：將步驟4所篩選的誘變菌株涂布于基礎培養基中，28?33.2℃，恒溫水浴震蕩培養24?36h。本發明以假絲酵母變種為出發菌株，復合誘變得到可穩定遺傳的高產菌株，其生產量明顯高于目前的報道，為微生物發酵生產3?羥基丙酸工業化提供了可能。

技術領域

本發明涉及生物發酵技術領域，尤其涉及一種誘變篩選高產3-羥基丙酸菌株的方法。

背景技術

3-羥基丙酸是三碳、無手性有機酸，與乳酸互為同分異構體。3-羥基丙酸具有羥基和羧基兩個官能團，是很多光學活性物質的前體。它脫水可以生成丙烯酸，氧化生成丙二酸，還原生成1，3-丙二醇，聚合生成高分子材料，是一種重要的化工平臺產品。2004年美國能源部將其列為當今世界12種最具潛力的化工產品之一。

目前，3-羥基丙酸的生產方法是化學合成法，主要有水合丙烯酸法和β-丙烯睛轉化法。但在碳末端引入功能團有很大的難度，且其產品不易分離提純，生產成本較高，生產過程存在不安全因素，而利用微生物發酵生產3-羥基丙酸可以有效地避免這些不利因素。微生物轉化法生產3-羥基丙酸的研究始于20世紀60年代，但一直處于實驗室階段，主要包括構建基因工程菌法和野生菌發酵法。基因工程法生產3-羥基丙酸有兩條途徑：以葡萄糖為底物和以甘油為底物的生物轉化路線。其中，北京工商大學的王鳳寰等人通過在肺炎克雷伯桿菌(K.pneumonia)中表達來自釀酒酵母的乙醛脫氫酶(ALDH)，得到了一株能同時利用甘油耦連生產3-羥基丙酸和1，3-丙二醇的重組菌，其3-羥基丙酸的產量為5g/L。已知的可發酵生產3-羥基丙酸的野生菌株主要有：Han-senula miso、Fusarium merismoides、Candidarugosa、Byssochlamys sp.、Rhodococcus erythropolis LG12和Klebsiellaterrigena。其中，李冰和裴疆森從自然壞境中篩選可代謝產生3-羥基丙酸的微生物菌株土生克雷伯氏菌(Klebsiellaterrigena)可以以甘油為唯一碳源生產3-羥基丙酸，產酸能力為1%(10g/L)，初次實現野生菌種從甘油直接裝化生成3-羥基丙酸。

目前，國內外研究的3-羥基丙酸生產方法多為構建基因工程菌法，微生物發酵生產3-羥基丙酸的實際應用還很少。為此提出一種誘變篩選高產3-羥基丙酸菌株的方法。

發明內容

本發明提出的一種誘變篩選高產3-羥基丙酸菌株的方法，以解決上述問題。

為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：

設計一種誘變篩選高產3-羥基丙酸菌株的方法，包括以下步驟：

步驟1、出發菌株的選擇：選用假絲酵母變種作為出發菌株；

步驟2、菌株的活化：將所述出發菌株接入活化培養基中，37℃，150-165r/min搖床培養24-36h，然后將培養液涂布到篩選培養基上，35-42℃，培養36-48h，挑取單菌落，重復活化操作，進行二次活化，得到二次活化的酵母菌液；

步驟3、菌株的多重誘變：

氯化鋰誘變：分別配制氯化鋰濃度為0%、O.3%、0.5%、0.7% .0.9%、和1%的活化培養基取1mL二次活化的酵母菌液分別接入不同濃度的氯化鋰活化培養基中，35-42℃，135r/min搖床培養24 h；

紫外誘變：然后取菌懸液8mL置于直徑9cm的培養皿中，在磁力攪拌下用15W紫外燈照射30s、60s、90s、120s；