[發(fā)明專利]一種誘變篩選高產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910040383.8
• 申請日: 2019-01-16
• 公開（公告）號: CN109852605A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李文;王陶;朱蘊蘭;劉安倩
• 申請（專利權(quán)）人: 徐州工程學(xué)院
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N1/16;C12R1/72
• 代理公司: 合肥律眾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 34147
• 代理人: 白凱園

1.一種誘變篩選高產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟1、出發(fā)菌株的選擇：選用假絲酵母變種作為出發(fā)菌株；

步驟2、菌株的活化：將所述出發(fā)菌株接入活化培養(yǎng)基中，37℃，150-165r/min搖床培養(yǎng)24-36h，然后將培養(yǎng)液涂布到篩選培養(yǎng)基上，35-42℃，培養(yǎng)36-48h，挑取單菌落，重復(fù)活化操作，進行二次活化，得到二次活化的酵母菌液；

步驟3、菌株的多重誘變：

氯化鋰誘變：分別配制氯化鋰濃度為0%、O.3%、0.5%、0.7% .0.9%、和1%的活化培養(yǎng)基取1mL二次活化的酵母菌液分別接入不同濃度的氯化鋰活化培養(yǎng)基中，35-42℃，135r/min搖床培養(yǎng)24 h；

紫外誘變：然后取菌懸液8mL置于直徑9cm的培養(yǎng)皿中，在磁力攪拌下用15W紫外燈照射30s、60s、90s、120s；

亞硝基胍誘變：稱取亞硝基胍放入無菌離心管中，加入濃度為10¹¹個/mL的菌懸液，使亞硝基胍終濃度為0.5mg/mL，充分溶解后置于35-38℃恒溫振蕩，作用時間分別為15min、25min、35min、45min；

步驟4、誘變菌株的篩選：

將步驟3所得到的右邊之后的菌懸液分別梯度稀釋至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6后，取不同濃度的菌懸液200μL涂布至篩選培養(yǎng)基上， 30-40℃培養(yǎng)48-72h，挑選透明圈與菌落直徑比值較大的單菌落進行保存；

步驟5、誘變菌株的復(fù)篩：

將步驟4所篩選的誘變菌株 涂布于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，28-33.2℃，恒溫水浴震蕩培養(yǎng)24-36h，通過測定發(fā)酵液中丙酸的含量確定篩選的菌株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變篩選高產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述假絲酵母變種(Candida sp.)，于2011年10月 14日保藏于中國微生物菌種保藏委員會管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.5344。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變篩選高產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述活化培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖20.00g，酵母浸膏10.00g，蛋白胨20.00g，瓊脂粉20.00g，無菌水1000mL。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種誘變篩選高產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述氯化鋰活化培養(yǎng)基為所述活化培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化鋰。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變篩選高產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述篩選培養(yǎng)基的組成成分為：葡萄糖20. 00 g， 酵母浸膏、10.00g ，(NH₄)₂SO₄、10.00g ，KH₂PO₄、5.00g ，K₂HPO₄、2.00g ，MgSO₄ ·7H₂0、1.00g ，F(xiàn)eSO₄·7H₂0、0.03g ，丙酸、2.00g，瓊脂粉、20.00g，無菌水、1000mL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變篩選高產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成成分為：蛋白胨10.00g、蔗糖20.00g、酵母膏10.00g、(NH₄)₃PO₄ 5.00g，無菌水、1000mL。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘變篩選高產(chǎn)3-羥基丙酸菌株的方法，其特征在于：所述活化培養(yǎng)基、篩選培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH均為7.0-7.5。