[發明專利]一種液質聯用測定血漿中塞來昔布濃度的方法

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• 申請號: 201910039851.X
• 申請日: 2019-01-16
• 公開（公告）號: CN109682912A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 黃靖智
• 申請（專利權）人: 徐州立興佳正醫藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/34
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務所 32205
• 代理人: 李妮

1.一種液質聯用測定血漿中塞來昔布濃度的方法，其特征在于：血漿樣品經預處理后經高效液相色譜-串聯質譜檢測其濃度，具體方法包括以下步驟：

(1)血漿樣品預處理：

血漿以K₂EDTA為抗凝劑，以塞來昔布-d7為內標；于96深孔板中精密加入100uL的血漿樣品，加入5uL的體積比為1：1的甲醇水溶液，混勻后加入5uL的2ng/uL的內標塞來昔布-d7溶液，混勻后加入1000uL乙腈于96深孔板中，渦旋混合1min，于20℃以3000rpm離心10min，取上層清液50uL至裝有450uL混合有機溶劑的96深孔板中，混合有機溶劑為乙腈：水：甲酸按照體積比50：50：0.2混合得到的混合物，渦旋混勻，于20℃以3000rpm離心5min后作為測試樣品待檢測；

(2)試樣測定：

取10uL測試樣品注入高效液相色譜-串聯質譜儀中，檢測樣品中塞來昔布和內標塞來昔布-d7的色譜峰，并據此計算所述血漿樣品中的塞來昔布濃度；

(3)液相色譜測定，條件為：

色譜柱：Agilent ZORBAX XDB-C18，5um，柱規格為50×2.1mm；色譜柱溫：40℃；流動相A：水/甲酸的體積百分比為100/0.2；流動相B：乙腈/甲酸的體積百分比為100/0.2；洗液：乙腈/水的體積百分比為50/50；自動進樣器溫度為15℃；梯度洗脫，流速為0.4mL/min，進樣量為10uL，分析時間3.5min；

(4)質譜測定，條件為：

離子源為電噴霧離子源，噴霧電壓為5000V，霧化溫度為480℃，噴霧氣壓力為20Psi，輔助加熱氣壓力為20Psi，氣簾氣壓力為30Psi，碰撞氣壓力為Low，去簇電壓分別為25eV的塞來昔布和塞來昔布-d7；碰撞室入口電壓分別為8eV的塞來昔布和塞來昔布-d7；碰撞電壓分別為37eV的塞來昔布和塞來昔布-d7；碰撞室出口電壓分別為15eV的塞來昔布和塞來昔布-d7；正離子方式檢測；掃描方式為多重反應監測；

用于定量分析的離子反應分別為：m/z382.1→m/z362.1，其為塞來昔布；和m/z389.1→m/z369.1，其為塞來昔布-d7。

2.根據權利要求1所述的一種液質聯用測定血漿中塞來昔布濃度的方法，其特征在于：所述步驟(3)中梯度洗脫的程序為：

3.根據權利要求1或2所述的一種液質聯用測定血漿中塞來昔布濃度的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，采用內標法，以塞來昔布和內標塞來昔布-d7的峰面積比值帶入標準曲線方程計算所述血漿樣品中的塞來昔布的濃度。

4.根據權利要求3所述的一種液質聯用測定血漿中塞來昔布濃度的方法，其特征在于：所述標準曲線方程的建立包括以下步驟：

取100uL空白血漿10份置于96深孔板中，以貯備液的形式添加5uL濃度分別為0.2ng/μL、0.4ng/μL、1ng/μL、2ng/μL、10ng/μL、16ng/μL、28ng/μL、40ng/μL的塞來昔布溶液至最低定量下限樣本、標樣1、標樣2、標樣3、標樣4、標樣5、標樣6、最高定量上限樣本中，分別加入5uL的體積比為1：1的甲醇水溶液至空白樣本和零濃度樣本，混勻后分別向最低定量下限樣本、標樣1、標樣2、標樣3、標樣4、標樣5、標樣6、最高定量上限樣本、零濃度樣本中加入5uL的2ng/uL的內標塞來昔布-d7溶液，向空白樣本中加入5uL的體積比為1：1的甲醇水溶液，混勻后分別向10份樣本中加入1000uL的有機溶劑乙腈，渦旋混合1min，于20℃以3000rpm離心10min，分別取上層清液50uL至裝有450uL混合有機溶劑的96深孔板中，混合有機溶劑為水：乙腈：甲酸按照體積比50：50：0.2混合得到的混合物，渦旋混勻，于20℃以3000rpm離心5min后作為10份標準樣品待檢測；

分別取10uL標準樣品注入高效液相色譜-串聯質譜儀中，檢測樣品中的塞來昔布和內標塞來昔布-d7的色譜峰，并據此得到標準曲線，以用于計算所述血漿中的塞來昔布的濃度。