[發明專利]一種利用微生物轉化制備寶丹酮的方法

有效

• 申請號: 201910037611.6
• 申請日: 2019-01-16
• 公開（公告）號: CN109852658B
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 張小強;曹桂陽;劉建
• 申請（專利權）人: 浙江仙琚制藥股份有限公司
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12R1/865;C12R1/85
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種制備寶丹酮的方法，利用酵母菌將1，4?雄烯二酮（ADD）轉化為寶丹酮，所述酵母菌是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.346或葡萄汁酵母Saccharomyces uvarum CGMCC 3.4636中的一種。本發明達到的有益效果是：1、利用生物轉化有效避免了化學方法中的強還原劑選擇性差、過程無法符合生產過程環保安全要求的缺陷；2、培養基價廉易得，培養轉化溫度較高，生長迅速，對無菌的要求不嚴格等優點；3、本發明工藝制備寶丹酮反應路線短，產品質量優異，適合工業化生產。

技術領域

本發明屬于甾體生物技術領域，特別涉及一種利用微生物轉化制備寶丹酮的方法。

背景技術

寶丹酮（17β-羥基-1,4-雄甾二烯-3-酮，CAS:846-48-0）, 又稱勃地酮，是蛋白同化劑的一種，具有增強血管供氧能力、增強肌肉、凸顯血管、增加食欲等作用。結構式為：

關于寶丹酮的制備方法，目前國內企業多是利用化學合成方法，從4-雄烯二酮（AD）和1，4-雄烯二酮（ADD）制備而來。

路線一：從4-雄烯二酮（AD）起始制備寶丹酮，需要用鉀硼氫類的還原劑對17位進行還原制備睪酮（TS），然后再利用微生物或化學方法進行1,2位脫氫制得寶丹酮。該方法第一步還原需要用到鉀硼氫類的還原劑，還原反應會同時對3位和17位酮基進行，雜質較多，收率不高。為避免3位酮基的副反應，一般需增加酮基保護和脫保護步驟，而脫氫步驟則需要用到細菌脫氫，或使用價格較貴的DDQ作脫氫試劑。該方法不僅存在路線較長、質量差的問題，而且在脫氫階段，采用細菌脫氫在培養和轉化過程中對無菌要求非常嚴格，使用DDQ脫氫則產品質量較差。

路線二：從1，4-雄烯二酮（ADD）制備寶丹酮。專利CN103030677報道，先對1，4-雄烯二酮（ADD）進行醚化保護，然后再還原17位酮基，脫保護之后獲得寶丹酮；專利CN104327143則通過優化反應條件提高還原劑的選擇性來一步獲得寶丹酮。這兩種方法雖然較從4-雄烯二酮（AD）起始制備寶丹酮路線有很大的進步，但都避免不了高還原性化學試劑的使用，這些還原劑在生產、儲運、使用中存在很高的安全風險，與安全綠色的生產要求相悖。

而對甾體上17位酮基的選擇性還原酶普遍存在于多種微生物中，篩選出合適的微生物并配合適當的發酵工藝完成該步反應，科學工作者在不懈努力。由于該類酶是屬于較為復雜的氧化還原酶，且多數微生物中酶活力不高，難以形成有競爭力的商業化過程；另外，該酶通常受微生物體內的營養狀態調控，會在營養貧乏時強化逆反應，重新把還原的羥基氧化為酮基，使得最終的轉化率較低，不利于分離純化。中國專利CN102168099中，發明人甚至將甾體1,2位脫氫酶基因轉入畢赤酵母中，構建出體內的對4-雄烯二酮（AD）的脫氫—酮基還原酶催化路線，但投料濃度僅有0.15%，商業化價值不大。

因此，尋找到合適的微生物，并建立生產過程綠色環保、健康安全，產品收率、質量和成本具有商業化競爭力的轉化工藝具有重要的意義。

發明內容

本發明的目的是：針對現有技術制備寶丹酮方法的缺陷，尋找一種選擇性高，且安全、綠色環保的制備寶丹酮的方法。本案發明人從多株微生物菌株中篩選到兩株酵母屬菌，選擇性地將1，4-雄烯二酮的17位酮基一步還原為β羥基，再經過分離純化步驟得到寶丹酮，這里所述酵母菌指的是釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，中科院微生物菌種保藏中心CGMCC 2.346，或葡萄汁酵母Saccharomyces uvarum，中科院微生物菌種保藏中心CGMCC3.4636；所述的1，4-雄烯二酮的投料濃度為0.5-0.75%；本發明具體的轉化路線如下所示：