[發明專利]標準質粒及制備方法、使用該質粒檢測重組EV71疫苗外源基因拷貝數的方法及方法的應用

有效

• 申請號: 201910032000.2
• 申請日: 2019-01-14
• 公開（公告）號: CN109777818B
• 公開（公告）日: 2022-12-20
• 發明（設計）人: 張改梅;顧美榮;劉建凱;朱征宇;甘建輝;鄭海發
• 申請（專利權）人: 深圳鑫泰康生物科技有限公司;北京民海生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
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本發明屬于腸道病毒71型的制備技術領域，特別涉及標準質粒及制備方法、使用該質粒檢測重組EV71疫苗外源基因拷貝數的方法及應用。本發明的標準質粒主要由內源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD經PCR擴增后連接于克隆載體中而構建而成，便于繪制出對應的標準曲線，以供重組EV71疫苗外源基因的拷貝數采用Taqman探針?熒光定量PCR的方法進行測定，能夠簡便快速、絕對定量、準確地對插入外源基因拷貝數進行分析，從而有效縮短了重組EV71疫苗外源基因拷貝數測定的檢測時間，便于多次重復操作。

技術領域

本發明屬于腸道病毒71型疫苗的制備技術領域，特別涉及標準質粒及制備方法、使用該質粒檢測重組EV71疫苗外源基因拷貝數的方法及方法的應用。

背景技術

手足口病(HFMD)是腸道病毒引起的常見傳染病之一。5歲以下嬰幼兒發病率最高，每年6～8月為流行季節，傳播途徑主要是呼吸道和經口感染。本病傳染性強，傳播途徑廣，傳播快，流行強度大，在短期內即可造成大流行。腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CVA16)是本病的主要致病原。較CVA16而言，EV71則兇險得多，90％以上的重癥病例和死亡病例都是由EV71病毒引起。

現有一種重組腸道病毒71型疫苗(漢遜酵母)(簡稱重組EV71疫苗)，該重組EV71疫苗是基于漢遜酵母平臺，將EV71的基因片段P1和基因片段3CD通過重組技術隨機整合于漢遜酵母的基因組中，形成重組基因組，其對應的漢遜酵母為重組漢遜酵母菌株。EV71的基因片段P1和基因片段3CD作為外源基因在重組漢遜酵母菌株的細胞基質內大量表達P1前體蛋白和3CD酶，其中3CD酶能對P1前體蛋白進行切割得到結構蛋白VP1-VP4，隨后自組裝得到腸道病毒71型無核酸的病毒樣顆粒，最后再經提取、純化等操作將該病毒樣顆粒從重組漢遜酵母菌株中分離出，以便于制成相應的病毒樣顆粒疫苗，相對于傳統的EV71疫苗具有更加優良的免疫原性和生物安全性。

在制備重組EV71疫苗過程中，確定重組EV71疫苗中外源基因P1和外源基因3CD的拷貝數對于細胞株的遺傳穩定性及后期生產具有非常重要的意義。

現有技術中，確定基因拷貝數的分析通常采用印跡雜交(Southern blot)，但該方法費時費力，所用DNA樣品量很大，通過顏色深淺判斷拷貝數，主觀判斷性強，不同的操作人員可能結果會有較大差異，并且探針是通過放射性標記的，對人體也有害。

另一種確定拷貝數變化的分析則采用熒光定量PCR，該方法是一種基于PCR反應體系加入非特異性染料(SYBR-Green)或者熒光標記的特異性探針，利用熒光信號積累實時監測整個PCR過程，從而獲得不同樣品達到一定的熒光信號(熒光閾值)時所需要的循環數(Ct值)。采用該方法測定基因的拷貝數時，需要先其將已知濃度標準品的Ct值與其初始濃度的對數繪制標準曲線，再將待測樣品的Ct值代入，便可計算待測樣品模板的初始濃度，具體反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰的特點，相對于印跡雜交法，能夠較好的確定外源基因的拷貝數。由此可知，標準品是準確測定基因拷貝數的關鍵因素。

然而，在實際操作過程中，由于EV71的基因片段P1和基因片段3CD插入漢遜酵母基因組的具體數量為不定值，而在標準品的構建過程中需要明確外源基因P1和外源基因3CD具體插入漢遜酵母基因組中的數量，由此難以直接使用外源基因P1和外源基因3CD制備成相應的標準品。因此，急需研發一種標準品，使得重組EV71疫苗外源基因的拷貝數能夠使用熒光定量PCR加以測定，以此有效提高測定重組EV71疫苗外源基因拷貝數的檢測效率和精確度。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明的第一個目的在于提供一種標準質粒，其選取漢遜酵母基因組中的結構基因MOX作為單拷貝對照基因，構建出含有內源基因MOX、外源基因P1、外源基因3CD的標準質粒，以此能夠明確外源基因P1和外源基因3CD插入漢遜酵母基因組中的具體數量，進而便于繪制出對應的標準曲線，以供重組EV71疫苗外源基因的拷貝數采用熒光定量PCR的方法進行測定。