[發(fā)明專利]標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒及制備方法、使用該質(zhì)粒檢測重組EV71疫苗外源基因拷貝數(shù)的方法及方法的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910032000.2
• 申請日: 2019-01-14
• 公開（公告）號: CN109777818B
• 公開（公告）日: 2022-12-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張改梅;顧美榮;劉建凱;朱征宇;甘建輝;鄭海發(fā)
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳鑫泰康生物科技有限公司;北京民海生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12Q1/70;C12Q1/6851;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，其特征在于，由內(nèi)源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD經(jīng)PCR擴(kuò)增后連接于克隆載體中構(gòu)建而成，其涉及的引物對如下：

引物對1，

MOX-F1：AATGAATTCTTCCTGTTGTGGACGACCT

MOX-R1：GATTGGCACCACCAGTGCTTGTTTCTCATA

引物對2，

EV71-P1-F1：TGAGAAACAAGCACTGGTGGTGCCAATCTC

EV71-P1-R1：AACTTCTCGTTGGGGTTGGGTGGAAGTTTG

引物對3，

EV71-3CD-F1：TCCACCCAACCCCAACGAGAAGTTCAGAGA

EV71-3CD-R1：AATGTCGACCTTACCAGACAGGTTCAGG

所述內(nèi)源基因MOX如SEQ ID No.1所示，所述外源基因P1如SEQ ID No.2所示，所示外源基因3CD如SEQ ID No.3所示；所述克隆載體選自pUC系列載體、pET系列載體和pGEX系載體中的一種。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，其特征在于，所述克隆載體為pUC18載體、pUC19載體、pET22b載體、pET28b載體、pET30a載體、pET32a載體、pGEX6P1載體中的一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

①、采用PCR擴(kuò)增技術(shù)，以重組EV71疫苗基因組為模板，分別制備出內(nèi)源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD，再以擴(kuò)增出的內(nèi)源基因MOX、外源基因P1和外源基因3CD為模板，擴(kuò)增出依次串聯(lián)的基因片段EV71-MOX-P1-3CD；

②、采用雙酶切技術(shù)，對克隆載體和步驟①擴(kuò)增得到的基因片段EV71-MOX-P1-3CD進(jìn)行酶切，分別得到載體片段和目的片段；

③、將步驟②制得的載體片段和目的片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒；

④、將步驟③得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，再將該感受態(tài)細(xì)胞涂布于對應(yīng)的培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，得到含有重組質(zhì)粒的單克隆菌株；

⑤、采用PCR/雙酶切及測序手段對步驟④得到的單克隆菌株加以鑒定；

⑥、對經(jīng)步驟⑤鑒定通過的單克隆菌株進(jìn)行擴(kuò)增，隨后用質(zhì)粒提取試劑盒對該單克隆菌株中的重組質(zhì)粒加以提純，得到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；

⑦、將步驟⑥中提純后的重組質(zhì)粒進(jìn)行濃度測定和質(zhì)量控制，通過公式計(jì)算分別得到內(nèi)源基因MOX、外源基因P1以及外源基因3CD的拷貝數(shù)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，步驟④中，所述感受態(tài)細(xì)胞為大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，其對應(yīng)的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。