[發明專利]一種酶法拆分制備N-甲基-D-天冬氨酸的方法

有效

• 申請號: 201910030583.5
• 申請日: 2019-01-14
• 公開（公告）號: CN109628519B
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 辛瑜;張梁;張瑤;高秋月
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12P13/20
• 分類號: C12P13/20;C12P41/00
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶啟新

本發明公開了一種酶法拆分制備N?甲基?D?天冬氨酸的方法，所述方法包括如下步驟：(1)將Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶基因構建于pMA5?YwbN?trsox質粒，并轉化Bacillus subtilis WB600細胞中進行分泌性表達；(2)將轉入pMA5?YwbN?trsox基因質粒的Bacillus subtilis WB600細胞進行發酵，獲得的培養液上清與N?甲基?DL?天冬氨酸溶液混合，針對N?甲基?L?天冬氨酸進行具有手性選擇性的生物催化；(3)采用等電點結晶法分離得到N?甲基?D天冬氨酸。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其是涉及一種酶法拆分制備N-甲基-D-天冬氨酸的方法。

背景技術

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)是動物機體中天然存在的一種氨基酸衍生物，分子式為C₅H₉NO₄，分子量為147.13，是哺乳動物中樞神經系統中重要的興奮性神經遞質L-谷氨酸同系物。NMDA一般僅存在于人和動物的神經和內分泌組織中，參與下丘腦-垂體生長軸的調控分泌作用，可明顯提高細胞內的Ca²⁺水平，并使cAMP濃度降低；NMDA也可參與神經內分泌的調節中起重要作用，顯著促進動物機體生長激素(GH)的分泌；通過抑制PC12細胞DNA合成而影響細胞的增殖活性，可用于抗腫瘤藥物的合成。能夠顯著促進動物腺垂體中生長激素、黃垂體生成素、促性腺激素釋放以及催乳素的分泌，是一種高效促生長的新型飼料添加劑。目前，NMDA已被開發作為一種新的功能性食品添加劑。

目前，N-甲基-D-天冬氨酸主要以化學法合成。其中，蔣光玉等人的論文(精細與專用化學品，2011,19(1):45-48)中采用了直接甲基化方法，以D-天冬氨酸為原料，經酯化反應合成D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽，D-天冬氨酸二甲酯鹽酸鹽在DMF溶劑中與碘甲烷反應生產N-甲基-D-天冬氨二甲酯，進一步在堿性條件下水解生成N-甲基-D-天冬氨酸。該方法反應步驟較多，且產品不易分離。此后，蔣光玉等人的專利(CN201110427732.5)中采用還原胺法，以D-天冬氨酸為原料，過量多聚甲醛、以及還原劑(氰基硼氫化鈉)在甲醇溶劑中反應，得到N-甲基-D-天冬氨酸。朱高峰等人的論文(化學試劑，2016,38(3),280-283)中采用了以D-天冬氨酸為原料，依次通過酯化、酰化、N-甲基化和水解四步反應制得目標化合物。化學法合成N-甲基-D-天冬氨酸主要存在步驟較多、操作復雜、試劑毒性較大等缺陷。在黃建坡等人的專利(201210130205.2)中，利用一種能夠表達N-甲基-L-天冬氨酸-β-脫羧酶的假單胞菌，特異性的將N-甲基-L-天冬氨酸轉化為N-甲基-L-丙氨酸，從而完成N-甲基-D-天冬氨酸的手性拆分。但假單胞菌存在潛在的致病性。

以上研究均存在一定的缺陷，為此，有必要開拓思路，尋找更為高效穩定的提取方法。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本申請提供了一種酶法拆分制備N-甲基-D-天冬氨酸的方法。本發明方法所用宿主菌Bacillus subtilis WB600具有較好的生物安全性，反應條件溫和，步驟簡單，產物分離快速，且具有較高的回收率。

本發明的技術方案如下：

一種酶法拆分制備N-甲基-D-天冬氨酸的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)用Thermomicrobium roseum肌氨酸氧化酶基因構建成pMA5-YwbN-trsox質粒，并轉化Bacillus subtilis WB600細胞中進行分泌性表達；

(2)將轉入pMA5-YwbN-trsox基因質粒的Bacillus subtilis WB600細胞進行發酵，獲得的培養液上清與N-甲基-DL-天冬氨酸溶液混合，針對N-甲基-L-天冬氨酸進行具有手性選擇性的生物催化；

(3)采用等電點結晶法分離得到N-甲基-D天冬氨酸。