[發(fā)明專利]一種基于基因型選擇的比利時(shí)毛色家兔純化方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910029901.6
• 申請(qǐng)日: 2019-01-11
• 公開（公告）號(hào): CN109680075B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊新忠;喬西波;惠春暉;王波;楊愛國(guó);胡家卿;李明勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6888
• 分類號(hào): C12Q1/6888
• 代理公司: 北京細(xì)軟智谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11471
• 代理人: 張肖

1.一種基于基因型選擇的比利時(shí)毛色家兔純化方法，其特征在于，所述純化方法包括以下步驟：

(1)提取待鑒定家兔的基因組DNA，分別使用第一引物組、第二引物組和第三引物組進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

(2)根據(jù)步驟(1)得到的所述擴(kuò)增產(chǎn)物，鑒別待鑒定家兔的基因型，篩選得到表型為比利時(shí)毛色的純合型家兔，所述篩選得到的純合比利時(shí)毛色家兔基因型為AAEECC；

步驟(1)中，所述待鑒定家兔為肉兔、獺兔、長(zhǎng)毛兔或觀賞兔類型中的任一種；所述待鑒定家兔毛色表型為比利時(shí)毛色；

所述第一引物組的正向引物為5’-AAGAAAGCAGGAAGGCACA-3’，反向引物為5’-CAAGGCAGGATTGGCTCA-3’；所述第二引物組的正向引物為5’-ACCTGCTGGTGAGCGTGA-3’，反向引物為5’-GTAGCGCAGTGCGTAGAAGA-3’；所述第三引物組的正向引物為5’-AAGACAAGGTGAAAGG-3’，反向引物為5’-TAAATCCAATAGGCAC-3’；

使用所述第一引物組擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系為：總體積為20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl₂25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA 50ng；擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃溫度下預(yù)變性5min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在94℃溫度下變性45s，在52℃下退火45s，在72℃溫度下延伸30s；完成30個(gè)循環(huán)之后，在72℃延伸5min，即完成PCR擴(kuò)增程序并在4℃下保存；使用所述第二引物組擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系為：總體積為20μL，包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)₂SO₄ 8.0mM、MgCl₂ 1.5mM、TWEEN-200.05％、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、Taq DNA聚合酶2.0U和模版DNA50ng；擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃溫度下預(yù)變性2min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在94℃溫度下變性45s，在62℃下退火45s，在72℃溫度下延伸60s；完成30個(gè)循環(huán)之后，在72℃延伸8min，即完成PCR擴(kuò)增程序并在4℃下保存；使用所述第三引物組擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增體系為：總體積為20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl₂25mM、dNTPs 0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、Taq DNA聚合酶2.5U和模版DNA 50ng；擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?4℃溫度下預(yù)變性5min；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，其中每個(gè)循環(huán)依次包括以下步驟：在94℃溫度下變性45s，在52℃下退火45s，在72℃溫度下延伸30s；完成30個(gè)循環(huán)之后，在72℃延伸5min，即完成PCR擴(kuò)增程序并在4℃下保存；

步驟(2)中，鑒別的方法為：對(duì)使用所述第一引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)ASIP基因第二外顯子的第5位點(diǎn)和第6位點(diǎn)間插入堿基“A”時(shí)，記為a基因型，未插入堿基“A”時(shí)，記為A基因型；

對(duì)使用所述第二引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)MC1R基因第280-285位點(diǎn)的堿基無(wú)缺失且304-333位點(diǎn)的堿基缺失30bp，記為E基因型；

對(duì)使用所述第三引物組得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)TYR基因第四外顯子的第1119位點(diǎn)的堿基類型，當(dāng)堿基為“C”時(shí)，未發(fā)生基因突變，記為C基因型，當(dāng)堿基為“A”時(shí)，發(fā)生基因突變，記為c基因型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，篩選得到的純合比利時(shí)毛色家兔在育種中應(yīng)用。