[發明專利]環介導等溫擴增單增李斯特菌的引物、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201910027710.6
• 申請日: 2019-01-11
• 公開（公告）號: CN109593866A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發明（設計）人: 朱麗萍;顏世敢
• 申請（專利權）人: 齊魯工業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
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本發明涉及環介導等溫擴增(LAMP)單增李斯特菌的引物、試劑盒及檢測方法。LAMP檢測引物包括2對引物，序列詳見序列表所示。LAMP檢測試劑盒包括引物、Bst DNA聚合酶、LAMP反應液以及陽性DNA模板。單增李斯特菌的LAMP檢測方法，使用上述試劑盒對樣品DNA進行LAMP反應，同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照，所述LAMP擴增條件為59?65℃反應30?60分鐘。本發明的單增李斯特菌的LAMP檢測引物、試劑盒具有特異性強、靈敏度高、便捷、高效等特點，能實現對單增李斯特菌的快速、精準檢測。

技術領域

本發明涉及微生物分子生物學檢測技術，特別是涉及單增李斯特菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒及檢測方法。

背景技術

單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)簡稱單增李斯特菌，是一種重要的人畜共患性致病菌和食源性致病菌。LM可以污染許多食品，包括家畜肉、發酵香腸和海產品等。LM感染或通過食用污染LM的食品，能引起人和動物的腦膜炎、敗血癥、嚴重胃腸炎及孕婦流產等，死亡率高達30％～70％。常見于老人、孕婦或免疫缺陷的人群，危害人的健康和生命財產安全。LM在4℃能生長繁殖，因此又被成為“冰箱殺手”。WHO將其與大腸桿菌O₁₅₇:H₇、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌并列為四大食源性致病菌，被列為國際上食源性疾病檢測的菌種之一，公共衛生和食品安全意義重大，越來越受到重視。2011年夏秋季美國科羅拉多州Jensen農場的甜瓜污染LM引起李斯特菌病的流行，造成146人發病，其中30例死亡。

對食源性致病菌的檢測主要有微生物分離培養法、生化特性鑒定法(現在API、VETEK等公司研發出了全自動生化分析儀)、免疫學方法(如ELISA、酶聯熒光免疫檢測法VIDAS、膠體金試紙法等)、分子生物學方法(PCR法、基因芯片法等)等。

傳統的微生物分離培養與生化鑒定是病原菌檢測的金標準。國標GB4789.30-2010《食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》就是建立在傳統的微生物分離培養與生化鑒定基礎上的。該法首先將檢測樣品在液體培養基中進行增菌培養，然后在固體培養基上進行選擇培養，最后進行生化特性鑒定和血清學鑒定。微生物的傳統檢測方法除操作繁瑣外，檢驗時間較長，一般需要5-15天的培養鑒定時間，時間上不能滿足快速檢測的要求。國標GB4789.30-2010《食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》中指定LM的生化鑒定項目包括細菌溶血反應、細菌動力試驗、過氧化氫酶試驗、糖發酵試驗。采用以表型特征為特點的生化特性鑒定法和血清學鑒定法對LM進行鑒定，但這些方法耗時長，鑒定能力有限，區分度差，常因LM的表型特征發生變異導致鑒定失敗，因此依靠表型特征不能準確鑒定的LM。

分子生物學檢測法能準確鑒定LM。該類方法是基于LM特定靶基因而建立起來的，包括PCR、多重PCR、熒光定量PCR等檢測方法，它們具有特異、靈敏、快速等優點，但存在需要昂貴、精密儀器(PCR儀或熒光定量PCR儀)、容易污染、技術含量高等缺點，PCR擴增后還要繼續進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外成像觀察，操作繁瑣、耗時，使用的熒光染料還會污染環境。

環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是基于檢測DNA的一種新型擴增技術。該技術依賴于識別靶序列上6-8個特異區域的4-6條特異引物和具有鏈置換特性的Bst DNA聚合酶，在58-65℃的等溫條件下擴增30-60分鐘，即可完成靶基因的高效、快速、高特異性擴增，產生肉眼可見的反應副產物-白色焦磷酸鎂沉淀。如果加入顯色染料，靈敏度還可以顯著提高。該技術具有不需要昂貴復雜的PCR儀、擴增產物不需要開蓋、用肉眼即可判斷結果、反應時間短、特異性強、靈敏度高等優點。只需要一臺簡單的加熱裝置，如普通的水浴鍋即可，因此有利于在現場檢測中推廣應用。LAMP方法與PCR方法相比，具有抗污染能力強、特異性高、靈敏度高、檢測時間短、結果可直觀判定、不需精密儀器、操作簡便等優點。LAMP目前已經成為食源性病原的新型檢測方法之一，在微生物檢測領域應用前景廣闊。