[發明專利]一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法

在審

• 申請號: 201910026348.0
• 申請日: 2019-01-11
• 公開（公告）號: CN109991213A
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 張明生;闕云飛;王曉紅;李雪;張智仙;賈娜
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 張梅

1.一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、以鉤藤根、鉤藤莖為材料，蒸餾水洗凈后通過徒手切片，選擇大小均勻、厚度為0.1～0.5mm的薄片置于載玻片上，分別用改良碘化鉍鉀染色劑、溴甲酚綠試劑及濃硝酸對鉤藤根、鉤藤莖切片進行染色；

b、另取鉤藤根、鉤藤莖洗凈后，根據步驟1中生物堿染色結果，將鉤藤根、鉤藤莖中著色結構與未著色結構剝離后均置于恒溫箱中，烘干溫度為35～75℃，烘干時間為3～8天，取出后磨粉過篩，收集備用；

c、取步驟2中鉤藤粉末0.5～2.0g置于錐形瓶中，加入2～10ml氨溶液潤濕10～90min，再加入甲醇，料液比為1:30～1:70g/mL，超聲提取20～60min，過濾后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液30mL，搖勻、過濾，緩沖劑定容到50mL即為供試液；取供試液4mL，酸性染料比色法的顯色條件為pH3.6的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液10mL，溴甲酚綠染液10mL，萃取劑萃取三次，每次4～8mL，定容至25mL，在紫外分光光度計413nm波長下取樣測定總生物堿OD值，以鉤藤堿為對照品制作標準溶液，做出標準曲線，最后計算出鉤藤樣品中總生物堿含量。

2.根據權利要求1所述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于：所述步驟a中每個試劑的染色處理時間均為15min，染色結束，試劑均吸干后滴加蒸餾水清洗，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察生物堿積累部位，以此為下一步組織結構剝離的依據。

3.根據權利要求1所述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于：所述步驟b中根據鉤藤根、鉤藤莖染色結果將著色結構與未著色結構剝離后均置于恒溫箱中，烘干溫度為55℃，烘干5天，磨粉過40目篩。

4.根據權利要求1所述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于：所述步驟c中，稱取1g鉤藤粉末于錐形瓶中，加入5ml氨溶液潤濕30min，再加入甲醇，料液比為1:50g/mL，超聲提取40min，過濾后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液30mL，搖勻、過濾，緩沖劑定容到50mL即為供試液；取供試液4mL，酸性染料比色法的顯色條件為pH3.6的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液10mL，溴甲酚綠染液10mL，萃取劑萃取三次，每次4mL，定容至25mL，并在紫外分光光度計413nm波長下取樣測定總生物堿OD值，以鉤藤堿為對照品制作標準曲線，最后計算出鉤藤樣品中總生物堿含量。

5.根據權利要求1所述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于：步驟c中所述的pH3.6的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液30mL由0.2mol/L鄰苯二甲酸氫鉀溶液25ml與0.1mol/L鹽酸6ml混合，加蒸餾水稀釋至100ml制得，PH為3.6。

6.根據權利要求1或4所述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于：步驟c中所述的萃取劑為三氯甲烷。

7.根據權利要求1所述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于：所述改良碘化鉍鉀染色劑為0.85g次硝酸鉍溶于10mL冰醋酸和40mL蒸餾水中，再與20mL40％的碘化鉀混合。

8.根據權利要求1所述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于：所述氨溶液由氨水、蒸餾水、無水乙醇按體積比9:30:16的比例配制而得。

9.根據權利要求1所述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，其特征在于：所述溴甲酚綠試劑由0.1g溴甲酚綠溶于2.8ml，0.05mol/LNaOH溶液中，蒸餾水定容至200ml制得。