[發明專利]一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法

在審

• 申請號: 201910026348.0
• 申請日: 2019-01-11
• 公開（公告）號: CN109991213A
• 公開（公告）日: 2019-07-09
• 發明（設計）人: 張明生;闕云飛;王曉紅;李雪;張智仙;賈娜
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78;G01N21/31
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 張梅

本發明公開了一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，以鉤藤根、莖徒手切片進行生物堿染色，根據染色結果剝離各著色部位并測定其總生物堿，明確生物堿儲存結構部位和含量，以此鑒別鉤藤藥材并確定藥材的綜合開發利用策略。傳統方法采收鉤藤藥材時，其根、莖、葉均未被利用，造成資源極大浪費。本發明以鉤藤根、莖為材料，進行生物堿染色觀察及總生物堿提取，從而確定生物堿在鉤藤中的積累部位及含量，并作為判定鉤藤藥材質量的有效方法，旨在改進其藥材的傳統利用方式，將根、莖、葉加以綜合利用，以實現其經濟效益的最大化。

技術領域

本發明涉及植物組織切片、生物堿染色及含量測定技術，具體涉及鉤藤徒手切片、生物堿染色和總生物堿含量測定方法。

背景技術

鉤藤[Uncaria rhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil.]為茜草科 (Rubiaceae)鉤藤屬(Uncaria Schreber nom.cons.)多年生木質藤本植物，以干燥帶鉤莖枝入藥。其味甘，性凉，歸肝、心包經；有息風定驚、清熱平肝等功效；用于肝風內動、驚癇抽搐、高熱驚厥、感冒夾驚、小兒驚啼、妊娠子癇及頭痛眩暈等癥。鉤藤中主要藥效成分為吲哚類生物堿，包括鉤藤堿、異鉤藤堿、去氫鉤藤堿、柯諾辛堿、柯南因堿等百余種，其中以鉤藤堿和異鉤藤堿含量較高。在鉤藤采集、收購過程中，藥商為避免鉤藤藥材摻假，而僅收購帶鉤枝條，其余部分被丟棄，由于鉤藤根、莖及葉雖不長鉤，但生物堿含量較高，被丟棄造成資源的極大浪費。

由于現有的收購過程中無法檢測鉤藤根、莖及葉的生物堿含量，藥商為避免鉤藤藥材摻假，而僅收購帶鉤枝條，其余部分被丟棄，從而造成資源的極大浪費。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法。該發明為鉤藤藥材鑒別及藥材資源的綜合開發利用開辟了新途徑，能避免鉤藤藥材摻假，同時減少鉤藤資源的浪費等優點。

本發明的技術方案：一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，包括以下步驟：

a、以鉤藤根、鉤藤莖為材料，蒸餾水洗凈后通過徒手切片，選擇大小均勻、厚度為0.1～0.5mm的薄片置于載玻片上，分別用改良碘化鉍鉀染色劑、溴甲酚綠試劑及濃硝酸對鉤藤根、鉤藤莖切片進行染色；

b、另取鉤藤根、鉤藤莖洗凈后，根據步驟1中生物堿染色結果，將鉤藤根、鉤藤莖中著色結構與未著色結構剝離后均置于恒溫箱中，烘干溫度為35～75℃，烘干時間為3～8天，取出后磨粉過篩，收集備用；

c、取步驟2中鉤藤粉末0.5～2.0g置于錐形瓶中，加入2～10ml氨溶液潤濕10～90min，再加入甲醇，料液比為1:30～1:70g/mL，超聲提取20～ 60min，過濾后55℃水浴蒸干甲醇，加入pH3.6的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液30mL，搖勻、過濾，緩沖劑定容到50mL即為供試液；取供試液4mL，酸性染料比色法的顯色條件為pH3.6的鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖液10mL，溴甲酚綠染液10mL，萃取劑萃取三次，每次4～8mL，定容至25mL，在紫外分光光度計413nm波長下取樣測定總生物堿OD值，以鉤藤堿為對照品制作標準溶液，做出標準曲線，最后計算出鉤藤樣品中總生物堿含量。

前述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，所述步驟a中每個試劑的染色處理時間均為15min，染色結束，試劑均吸干后滴加蒸餾水清洗，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察生物堿積累部位，以此作為下一步組織結構剝離的依據。

前述的一種基于組織化學定位與化學成分分析的鉤藤生物堿檢測方法，所述步驟b中根據鉤藤根、鉤藤莖染色結果將著色結構與未著色結構剝離后均置于恒溫箱中，烘干溫度為55℃，烘干5天，磨粉過40目篩。