[發明專利]一種H5亞型禽流感病毒的快速檢測方法

有效

• 申請號: 201910025206.2
• 申請日: 2019-01-11
• 公開（公告）號: CN109628643B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發明（設計）人: 蔣文明;劉華雷
• 申請（專利權）人: 中國動物衛生與流行病學中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明提供一種H5亞型禽流感病毒的快速檢測方法，通過比對了近年來分離到的H5亞型禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守區設計了引物和探針，建立了針對H5亞型禽流感病毒實時熒光定量RT?PCR核酸快速檢測方法。本發明所提供的H5亞型禽流感病毒實時熒光RT?PCR方法具有靈敏度高、檢測時間短，不需要電泳等開放環節，只需一臺熒光PCR儀即可在密閉反應管中完成，且在檢測過程中可實時查看反應曲線，對結果作出快速判斷。而作為禽流感診斷金標準的病毒分離方法，則需要更多的設備、更長的時間、更高的硬件要求。

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，具體涉及一種H5亞型禽流感病毒的快速檢測方法。

背景技術

1996年，我國首次從廣東的鵝體內分離到H5N1亞型高致病性禽流感病毒。從2003年末開始，H5N1亞型禽流感在東南亞多個國家的家禽中暴發，包括越南、泰國、韓國、日本、柬埔寨和印度尼西亞。2004年至2015年，我國的多個省份暴發了疫情，超過2千萬只禽類被撲殺，給養禽業造成了巨大的經濟損失。2005年底開始，我國針對H5亞型禽流感病毒實行大規模強制免疫政策，疫情開始得到了有效控制。實踐證明，在禽流感防控方面，疫苗免疫發揮了巨大的作用。

但是，不可否認，它也帶來了一系列的問題，如免疫加快了病毒變異，使得疫苗必須加快更新換代。隨著病毒的進化，H5亞型禽流感病毒一直在發生較快的變異；從最初的N28、Re-1到Re-4、Re-5，再到Re-6、Re-8，到最新的Re-11、Re-12。病毒變異是由于其血凝素基因(HA)中核苷酸的變異引起的。目前，全球H5亞型禽流感病毒共存在10個分支。我國存在或流行的分支包括第0分支、第2.3.4.4分支、第2.3.2.1分支和第7分支共4個分支。我國現在流行的毒株與1996年最初分離的病毒A/goose/Guangdong/1/1996(H5N1)的HA核苷酸同源性僅為90.6％(Re-11)和91.2％(Re-12)。以Re-11和Re-12疫苗株為代表的第2.3.4.4分支和第2.3.2.1分支HA核苷酸同源性僅為88.5％。HA核苷酸的快速變異增加了以核苷酸為靶基因的檢測方法的難度，導致以HA基因為靶基因的檢測方法的特異性、敏感性下降，造成假陰性的結果。而病毒分離作為禽流感診斷的金標準，耗時較長、需要的硬件較高，不適合臨床的快速診斷和應用。

發明內容

本發明提供一種H5亞型禽流感病毒的快速檢測方法，通過比對了近年來分離到的H5亞型禽流感病毒HA基因核苷酸序列，在其保守區設計了引物和探針，建立了針對H5亞型禽流感病毒實時熒光定量RT-PCR核酸快速檢測方法。

本發明首先提供一種用于H5亞型禽流感病毒檢測的引物組和探針，其序列信息如下：

其中上游引物的序列為ATGGAAAARAACGTYACTGT(SEQ?ID?NO.1)，

下游引物序列為AGCCATCCWGCYACACTRCAAT(SEQ?ID?NO.2)；

探針序列為AAGACATACTGGARAAGACACAYAAYGGGA(SEQ?ID?NO.3)，

其中探針的5'端標記FAM，3'端標記BHQ1；

本發明的引物組和探針用于制備使用實時熒光定量RT-PCR方法檢測H5亞型禽流感病毒的試劑盒；

本發明再一個方面提供一種檢測H5亞型禽流感病毒的方法，包括如下的步驟：

1)配置反應體系：

在聚合酶鏈式反應管中依次加入含dNTPs、Mg²⁺的2×qRT-PCR反應緩沖液25μl、水7.0μl、濃度為10μmol/L上游引物2.0μl、濃度為10μmol/L的下游引物2.0μl、濃度為10μmol/L的探針1.5μl、酶混合物2.5μl、需要檢測的病毒核酸樣品10.0μl；

2)反應步驟：