[發(fā)明專利]一種基于生物素量子點(diǎn)探針的C反應(yīng)蛋白超敏檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910020134.2
• 申請(qǐng)日: 2019-01-09
• 公開（公告）號(hào): CN109633174B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉丹;馬碧書;劉佳;姜雨薇;李貞;張?jiān)茓?/a>;羅佳;徐天凱;張明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明醫(yī)科大學(xué)海源學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 昆明金科智誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 53216
• 代理人: 胡亞蘭

1.一種基于生物素量子點(diǎn)探針的C反應(yīng)蛋白超敏檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，以下簡(jiǎn)稱CRP)，包括以下檢測(cè)步驟：

步驟一、分別在盛有包被好抗-CRP固相單抗的膜芯片基底的西林瓶中，各自加入2mL含有10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL的C反應(yīng)蛋白溶液，37℃孵育1h后用濃度為0.01mol/L，pH＝7.4的PBS沖洗三遍；

步驟二、分別加入2mL含有0.01mg/mL鏈霉親和素和抗CRP單抗耦合的QDs探針受體蛋白的PBS溶液，37℃孵育30min后用濃度為0.01mol/L，pH＝7.4的PBS沖洗三遍；

步驟三、加入2mL 1:2000倍稀釋的生物素化熒光QDs，37℃下孵育20min后用濃度為0.01mol/L，pH＝7.4的PBS沖洗三遍，氮?dú)饪焖俅蹈衫w維素基底膜后用紫外——可見光分光光度計(jì)測(cè)量其熒光強(qiáng)度；

所述步驟二所述鏈霉親和素和抗CRP單抗耦合的QDs探針受體蛋白的制備方法為：

(1)、將80μg CRP單抗溶解于100μL超純水中，超聲溶解5min，嚴(yán)格控制水浴溫度不能超過(guò)40℃；

(2)、加入150μL 0.1M新鮮配制的過(guò)碘酸鈉溶液，室溫下避光反應(yīng)30min；

(3)、反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)溶液裝入截留分子量為10kDa的透析袋中，于1mM,pH＝4.5的醋酸鈉溶液中4℃下透析過(guò)夜；

(4)、透析結(jié)束后加入0.2M pH＝9.5的碳酸鈉緩沖液2μL，調(diào)節(jié)溶液的pH到9.5，之后立即加入20μL溶解有150μg鏈霉親和素的0.1M碳酸緩沖液中，室溫下避光輕微攪拌2.5小時(shí)；

(5)、反應(yīng)結(jié)束后快速加入100μL新鮮配制的4.5mg/mL硼氫化鈉，充分混合均勻，在4℃輕微攪拌反應(yīng)2小時(shí)，還原抗體分子表面過(guò)多氧化的糖基；

(6)、反應(yīng)結(jié)束后將上述產(chǎn)物置于透析袋中，在0.15M，PH＝7.4的PBS緩沖液中4℃下透析24小時(shí)，每8小時(shí)更換一次透析液；

(7)、將透析后的產(chǎn)物置于截留分子量為100kD的濃縮離心管中，于3000rpm下離心30min，除去未反應(yīng)的蛋白；

(8)、濃縮離心后的產(chǎn)物利用G25 Sephadex瓊脂葡聚糖凝膠分子篩層析柱純化分離，測(cè)定濃度后于4℃保存待用，于此制備出鏈霉親和素和抗CRP單抗耦合的生物素QDs熒光探針受體蛋白；

步驟三所述的生物素化熒光QDs探針的制備方法為：

(1)、取300μL濃度為10mg/mL水溶性QDs于離心管中，加入900μL 0.1M pH＝4.7MES后超聲分散5min，混合后體積為1200μL；

(2)、分別加入2.2mM EDC和4.5mM NHS，37℃下避光反應(yīng)40min；

(3)、29000rpm下冷凍高速離心30min后棄上清，用0.01M pH＝7.4的PBS溶液沖洗后將量子點(diǎn)分散于該溶液中重復(fù)離心后將沉淀再次分散于上述PBS溶液中；

(4)、于溶液中加入0.78mg/mL生物素乙二胺PBS溶液，在37℃下避光反應(yīng)3h；

(5)、用含1.5％BSA的PBS溶液封閉45min后于30000rpm冷凍高速下離心30min棄上清；

(6)、將得到的沉淀再次分散于0.01M pH＝7.4的PBS溶液中4℃保存待用，于此制備出生物素化熒光QDs探針。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，步驟一所述CRP固相抗體的膜芯片基底的制備方法：

將表面羧基化處理的纖維素濾膜片放置于西林瓶中，加入濃度為0.15mol/L、pH＝4.7的MES緩沖溶液1000μl，分別加入2.5mmol EDC和4.5mmol Sulfo-NHS在20℃下反應(yīng)45min，之后將膜片取出，用濃度為0.01mol/L、pH＝7.4的PBS緩沖溶液沖洗干凈膜片表面殘留的反應(yīng)液，將之放置于濃度為0.01mol/L、pH＝7.4的1000μl PBS緩沖溶液中，同時(shí)加入CRP固定抗體，使溶液中抗體的終濃度為20μg/ml，20℃～25℃下避光反應(yīng)3.5h，反應(yīng)結(jié)束后取出濾膜，用濃度為0.01mol/L、pH＝7.4的PBS緩沖溶液再次將膜片表面殘留的反應(yīng)液沖洗干凈后加入1％BSA溶液于37℃孵育封閉40min，之后將膜片用濃度為0.01mol/L、pH＝7.4的PBS緩沖溶液沖洗三遍后待檢測(cè)用，于此制備出固定有CRP捕獲抗體的膜芯片基底。