[發明專利]聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體及其構建方法和在卵巢癌中的應用

在審

• 申請號: 201910019807.2
• 申請日: 2019-01-09
• 公開（公告）號: CN109680004A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 田曉麗
• 申請（專利權）人: 上海美麗人生醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N15/62;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務所(普通合伙) 32260
• 代理人: 王闖

本發明屬于醫藥生物領域，具體涉及聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體及其構建方法和在卵巢癌中的應用。所述的雙靶點CAR載體通過聯合EpCAM單鏈抗體和MSLN單鏈抗體，CAR的具體組成結構為CD8leader?EpCAM scFv?(G₄S)₅?MSLN scFv?CD8α?CD28?CD137?CD3ζ。以病毒感染方式獲得含有該治療載體的CAR?T細胞(Chimeric Antigen Receptor T?Cell)，通過表達CAR結構，可靶向識別和殺傷高表達EpCAM和MSLN兩種腫瘤相關抗原的卵巢癌細胞。

技術領域

本發明屬于醫藥生物領域，具體涉及聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體及其構建方法和在卵巢癌中的應用。

背景技術

卵巢癌是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，其死亡率占女性惡性腫瘤的第一位，是女性癌癥病人死亡的首要死因。目前卵巢癌的治療方法有手術治療、化療、中醫治療、免疫治療等。近年來，隨著基礎科學研究的不斷發展，免疫治療越來越受到人們的重視。

LAK細胞、DC、CIK細胞都曾作為腫瘤的免疫治療手段，但是以上各種治療方法均缺乏特異性識別腫瘤相關抗原(tumor associated antigen，TAA)和殺傷特定腫瘤靶細胞的能力；而腫瘤免疫編輯的過程又會使靶細胞表面的主要組織相容性復合物(mainhistocompatibility complex，MHC)在腫瘤細胞表面表達下降，形成免疫逃逸，使腫瘤細胞可成功躲避T細胞攻擊。

嵌合抗原受體(CAR)-T細胞療法是通過基因工程技術在T細胞表面人為過表達能識別特定的腫瘤表面抗原的單鏈抗體可變區基因片段，從而使T細胞識別特定抗原、殺傷表達該抗原的靶細胞。同時，由于CAR-T細胞是采用抗體識別抗原模式，因此不受MHC的限制。

上皮特異性粘附分子(EpCAM,Epithelial cell adhesion molecule)是一種上皮細胞跨膜糖蛋白，參與Wnt信號轉導通路，調控靶基因轉錄，與細胞的粘附、遷移、增殖、分化等有關。最初是以一種腫瘤相關抗原而被發現的，由于EpCAM在多種腫瘤組織如卵巢癌、胃癌、結直腸腺癌、乳腺癌等中的表達升高而備受關注。研究發現，EpCAM的表達與卵巢腫瘤的進展及預后相關，可作為卵巢癌靶向治療的靶點。

間皮素(mesothelin，MSLN)是一種存在于細胞表面的錨定糖蛋白，因其在正常組織中不表達或間皮組織中低表達，但在30％的腫瘤中高表達，如卵巢癌、胃癌、結腸癌等實體瘤，而成為備受關注的腫瘤細胞特異性靶向抗原。

脫靶效應是CAR-T細胞療法副作用的主要來源，脫靶效應是指未能達到預先設定的目標，有所偏移的現象。CAR-T細胞胞外識別結構域絕大多數為腫瘤相關抗原(Tumorassociated antigen，TAA)，而腫瘤相關抗原并非腫瘤細胞所特有，其在健康組織上也存在不同程度的表達。這種CAR-T細胞在殺傷腫瘤細胞的同時也會攻擊正常組織，這種毒性即非腫瘤靶向毒性，該毒性機制造成的毒性效應稱為脫靶效應。

因此，如何有效的避免降低脫靶效應的發生，增強T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷，從而提高CAR-T免疫療法抗卵巢癌的效果，成為CAR-T治療的一個技術難題。

目前，尚未見有關能靶向EpCAM和MSLN的雙靶點的治療方案，以降低脫靶效應發生的CAR載體的報道。

發明內容

本發明目的是為了解決上述問題，本發明提供了能靶向EpCAM和MSLN并減少脫靶效應發生的CAR載體。本發明所采用的針對EpCAM和MSLN的CAR-T技術，降低CAR-T細胞療法的脫靶效應的發生，增強T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷，從而提高CAR-T免疫療法抗卵巢癌的效果。此外，還包括聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體的構建方法及其應用。