[發明專利]聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體及其構建方法和在卵巢癌中的應用

在審

• 申請號: 201910019807.2
• 申請日: 2019-01-09
• 公開（公告）號: CN109680004A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 田曉麗
• 申請（專利權）人: 上海美麗人生醫療科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N15/62;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 無錫市匯誠永信專利代理事務所(普通合伙) 32260
• 代理人: 王闖

1.聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體，其特征在于，包括嵌合抗原受體和載體，所述嵌合抗原受體連接在所述載體上，

所述嵌合抗原受體包括EpCAM單鏈抗體和MSLN單鏈抗體兩種特異性結構，所述EpCAM單鏈抗體的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MSLN單鏈抗體的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，

所述嵌合抗原受體的結構組成為CD8leader-EpCAM scFv-(G₄S)₅-MSLNscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ。

2.根據權利要求1所述的聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體，其特征在于，所述CD8leader可表達引導新合成的蛋白質進行跨膜轉移的引導肽，所述CD8leader的核苷酸序列SEQ ID NO.1所示，

所述EpCAM scFv表示EpCAM單鏈抗體，

所述(G₄S)₅為單鏈抗體間鉸鏈Inner-Linker，且核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述EpCAM單鏈抗體和MSLN單鏈抗體通過所述(G₄S)₅進行連接，

所述MSLN scFv表示MSLN單鏈抗體，

所述CD8α為跨膜區，連接胞外抗原結合域和胞內信號域，且核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，

所述CD28-CD137為共刺激結構域，所述CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，

所述CD3ζ為為信號轉導域，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

3.根據權利要求1所述的聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體，其特征在于，所述載體包括PUC19質粒、慢病毒載體。

4.根據權利要求4所述的聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體，其特征在于，所述慢病毒載體為pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。

5.聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體的構建方法，用于構建如權利要求1-4任一項所述的聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體，其特征在于，所述構建方法的步驟如下：

(1)將所述嵌合抗原受體保存在所述PUC19質粒上；

(2)將含有步驟(1)中PUC19質粒和所述慢病毒載體進行雙酶切，將酶切產物分別經過瓊脂糖凝膠電泳分離，獲得雙酶切后的含有所述嵌合抗原受體結構的目的片段和雙酶切后慢病毒載體，

(3)將步驟(2)中的目的片段和步驟(2)中的慢病毒載體進行連接，將連接產物進行轉化，提取質粒，獲得含有嵌合抗原受體結構的重組質粒，所述重組質粒為聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體。

6.根據權利要求5所述的聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體的構建方法，其特征在于，所述步驟(2)中的雙酶切位點為EcoRI和NotI，所述(3)的含有所述嵌合抗原受體結構的目的片段和慢病毒載體連接的摩爾比為5:1。

7.聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體的應用，基于權利要求1-4任一項所述的聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體，其特征在于，聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體進行慢病毒包裝，經離心濃縮后獲得高滴度的慢病毒懸液，所述慢病毒懸液用于感染T細胞，獲得CAR-T細胞，所述CAR-T細胞通過識別特異性蛋白EpCAM和MSLN靶向殺傷卵巢癌細胞。

8.根據權利要求7所述的聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體的應用，其特征在于，所述慢病毒包裝采用三質粒包裝系統，所述三質粒包裝系統包括PSPAX2質粒、pMD2G質粒和所述聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體，所述PSPAX2質粒、所述pMD2G質粒、所述聯合EpCAM和MSLN單鏈抗體的雙靶點CAR載體的比例為27:3:20，所述慢病毒包裝采用293T細胞作為慢病毒的包裝細胞。