[發(fā)明專(zhuān)利]芽孢桿菌H3、由其發(fā)酵魚(yú)皮制備膠原蛋白多肽的用途和膠原蛋白多肽

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910018343.3
• 申請(qǐng)日: 2019-01-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109486730A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李曉暉;韓瑋;刑瀚文;施文正;鐘建
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C07K14/78;C12P21/02;C12R1/07
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 胡永宏

本發(fā)明提供芽孢桿菌H3、由其發(fā)酵魚(yú)皮制備膠原蛋白多肽的用途和膠原蛋白多肽，所述芽孢桿菌H3的保藏號(hào)為CGMCCNO：15830，可以從土壤中分離得到；利用芽孢桿菌H3制備種子液，魚(yú)皮粉碎制備發(fā)酵培養(yǎng)基，依次經(jīng)接菌發(fā)酵、發(fā)酵液離心、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥，制得膠原蛋白多肽；所得膠原蛋白多肽保留完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有良好的溶解性、乳化性和穩(wěn)定性。與現(xiàn)有膠原蛋白多肽的制備方法相比，工藝簡(jiǎn)單，操作方便，且不需使用大量化學(xué)試劑，有利于環(huán)境保護(hù)，提取的膠原蛋白多肽分子量更小，易吸收，可用于食品、化妝品和保健品領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于膠原蛋白多肽制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物菌株芽孢桿菌H3，以及由該菌株發(fā)酵魚(yú)皮制備膠原蛋白多肽的用途，還涉及膠原蛋白多肽及其制備方法。

背景技術(shù)

膠原蛋白是一種白色、不透明、無(wú)支鏈的纖維蛋白質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，也是是動(dòng)物結(jié)締組織中的主要成分，主要存在于動(dòng)物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白。膠原蛋白的來(lái)源和營(yíng)養(yǎng)十分豐富，其結(jié)構(gòu)和功能特性具有多樣性和復(fù)雜性，在生物制藥、醫(yī)療保健、美容化妝、組織工程、食品工業(yè)等領(lǐng)域都能發(fā)揮功效，具有良好應(yīng)用前景。

然而，由于其分子量很大，不利于腸胃和皮膚的吸收，限制了其生物活性。與膠原蛋白相比，膠原蛋白多肽不僅有膠原蛋白的營(yíng)養(yǎng)特性，而且具有易于消化吸收、低過(guò)敏性、食用安全等優(yōu)點(diǎn)。此外，膠原蛋白多肽還具有抗氧化、降血壓、提高免疫力、改善記憶力和抗腫瘤等生物活性。現(xiàn)有的膠原蛋白肽生產(chǎn)方法中脫脂、去腥、脫色等工序單獨(dú)進(jìn)行，工藝較為復(fù)雜、成本高，且所用的純酶制劑價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種由微生物發(fā)酵魚(yú)皮制備膠原蛋白多肽的方法，解決現(xiàn)有的膠原蛋白肽生產(chǎn)方法中脫脂、去腥、脫色等工序單獨(dú)進(jìn)行時(shí)工藝較為復(fù)雜、所用純酶制劑價(jià)格昂貴導(dǎo)致成本較高的問(wèn)題。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種產(chǎn)生膠原蛋白酶的菌株芽孢桿菌(Bacillus)H3，由該芽孢桿菌H3制得膠原蛋白酶，并經(jīng)微生物發(fā)酵魚(yú)皮制備上述膠原蛋白多肽。

本發(fā)明的上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明的第一方面，芽孢桿菌H3，其保藏號(hào)為CGMCCNO：15830。

進(jìn)一步地，所述芽孢桿菌H3可土壤中分離篩選得到，其16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

進(jìn)一步地，所述芽孢桿菌H3的分離篩選方法為：

(1)制備富集培養(yǎng)液：稱(chēng)取土樣1g，在無(wú)菌條件下接入含有50mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，160～180r/min、37℃搖瓶培養(yǎng)3天，富集培養(yǎng)三次，得富集培養(yǎng)液；其中，所述富集培養(yǎng)基由質(zhì)量體積比為1:10(w:v)的魚(yú)皮和蒸餾水組成；

(2)稀釋涂布：將步驟(1)制備的富集培養(yǎng)液梯度稀釋后涂布于初篩平板上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察菌落生長(zhǎng)情況；

(3)分離純化：從步驟(2)的菌株中挑選單菌落，進(jìn)行平板劃線(xiàn)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

(4)明膠液化：對(duì)步驟(3)的單菌落進(jìn)行明膠穿刺，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并取上清測(cè)定酶活后確定膠原蛋白酶活力高的菌株，即得。

進(jìn)一步地，所述芽孢桿菌H3的鑒定方法為：將上述分離得到的菌株H3于37℃在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中劃線(xiàn)培養(yǎng)生長(zhǎng)，菌落圓形，表面濕潤(rùn)、不透明、邊緣不整齊，為白色或微黃色；挑取其中單菌落進(jìn)行革蘭氏染色后呈紫色、短桿狀，說(shuō)明菌株H3為革蘭氏陽(yáng)性菌；再以菌株H3總DNA為模板，采用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)得到一條清晰條帶，測(cè)序得到16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示，去掉雜峰區(qū)序列后的1446bp，在NCBI上同源性比較，Bacilluscereus.HYM88的同源性為99％，說(shuō)明菌株H3屬于芽孢桿菌。