[發明專利]芽孢桿菌H3、由其發酵魚皮制備膠原蛋白多肽的用途和膠原蛋白多肽

在審

• 申請號: 201910018343.3
• 申請日: 2019-01-09
• 公開（公告）號: CN109486730A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 李曉暉;韓瑋;刑瀚文;施文正;鐘建
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C07K14/78;C12P21/02;C12R1/07
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 胡永宏

1.芽孢桿菌H3，其保藏號為CGMCCNO：15830。

2.如權利要求1所述的芽孢桿菌H3，其特征在于，可土壤中分離篩選得到，其16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

3.如權利要求1或2所述的芽孢桿菌H3，其特征在于，所述芽孢桿菌H3的分離篩選方法為：

(1)制備富集培養液：稱取土樣1g，在無菌條件下接入含有50mL富集培養基的三角瓶中，160～180r/min、37℃搖瓶培養3天，富集培養三次，得富集培養液；其中，所述富集培養基由質量體積比為1:10(w:v)的魚皮和蒸餾水組成；

(2)稀釋涂布：將步驟(1)制備的富集培養液梯度稀釋后涂布于初篩平板上，37℃培養箱中培養24h，觀察菌落生長情況；

(3)分離純化：從步驟(2)的菌株中挑選單菌落，進行平板劃線，37℃培養箱培養；

(4)明膠液化：對步驟(3)的單菌落進行明膠穿刺，37℃培養箱培養，并取上清測定酶活后確定膠原蛋白酶活力高的菌株H3，即得。

4.如權利要求3所述的芽孢桿菌H3，其特征在于，所述菌株H3的鑒定方法為：

將上述分離得到的菌株H3于37℃在營養瓊脂培養基中劃線培養生長，菌落圓形，表面濕潤、不透明、邊緣不整齊，為白色或微黃色；挑取其中單菌落進行革蘭氏染色后呈紫色、短桿狀，說明菌株H3為革蘭氏陽性菌；再以菌株H3總DNA為模板，采用16SrDNA通用引物進行PCR擴增，檢測得到一條清晰條帶，測序得到16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示，去掉雜峰區序列后的1446bp，在NCBI上同源性比較，Bacilluscereus.HYM88的同源性為99％，說明菌株H3屬于芽孢桿菌。

5.權利要求1～4任一項所述芽孢桿菌H3在制備膠原蛋白多肽的用途，其特征在于，通過所述芽孢桿菌H3發酵魚皮制得。

6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，通過所述芽孢桿菌H3接種于由魚皮制備的發酵培養基制得。

7.如權利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述芽孢桿菌H3發酵魚皮制備膠原蛋白多肽的方法包括：

(ⅰ)將干魚皮剪成0.5cm×0.5cm的若干小塊，粉碎后所得碎魚皮121℃滅菌20min，或與蒸餾水以質量體積比為1～5：50混合后121℃滅菌20min，得發酵培養基；

(ⅱ)將權利要求1～4任一項所述芽孢桿菌H3接入牛肉膏蛋白胨斜面培養基37℃培養24h進行活化，活化后的菌種接入牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于37℃、160～180r/min搖床培養24～28h，制得種子液；其中，所述牛肉膏蛋白胨液體培養基為3g牛肉膏、10g蛋白胨和5gNaCl溶于1000mL蒸餾水而得，pH7.2～7.4；

(ⅲ)將步驟(ⅱ)所得種子液接種于步驟(ⅰ)中的發酵培養基中，所述芽孢桿菌H3的接種量為4％～10％，于25℃～40℃、160～180r/min進行發酵培養28h～56h，制得發酵液；其中，

當步驟(ⅰ)中所述發酵培養基為粉碎后所得碎魚皮121℃滅菌20min時，步驟(ⅲ)中發酵溫度為25℃～30℃，發酵時間為28h～36h；

當步驟(ⅰ)中所述發酵培養基為粉碎后所得碎魚皮與蒸餾水以質量體積比為1～5：50混合后121℃滅菌20min時，步驟(ⅲ)中發酵溫度為30℃～40℃，發酵時間為36h～56h；

(ⅳ)將步驟(ⅲ)所得發酵液4000r/min離心30min，取上清液，去除雜質，進行真空冷凍干燥48h，得到膠原蛋白多肽。

8.膠原蛋白多肽，其特征在于，其分子量為45kDa～60kDa，且具有完整三螺旋結構；其通過權利要求1～4任一項所述芽孢桿菌H3發酵魚皮制得。