[發明專利]大規模生產符合GMP規范的臨床級外泌體

在審

• 申請號: 201910015538.2
• 申請日: 2019-01-08
• 公開（公告）號: CN109628392A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 段莉;王大平;梁宇杰;徐曉;李興福;歐陽侃
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京匯捷知識產權代理事務所(普通合伙) 11531
• 代理人: 馬金華

本發明屬于生物技術領域，公開了大規模生產符合GMP規范的臨床級外泌體，該方法包括以下步驟：S1：獲取細胞沉淀，首先抽取病人膝關節積液，離心獲得細胞沉淀，留取備用；S2：培養間充質干細胞，在符合GMP的要求下利用無血清培養基對人關節來源的間充質干細胞進行培養，留取備用；S3：生物反應器的預處理；S4：接種培養間充質干細胞；S5：培養獲得外泌體。該發明所制備的外泌體具有較好的穩定性、生物相容性、生物穩定性，且制作步驟簡單，降低了相應的生產成本，可大規模進行生產，直接提取細胞沉淀中的間充質干細胞，然后進行培養，培養完成后將上清液高速離心后即可獲得所需的外泌體，適合推廣。

技術領域

本發明涉及生物領域，具體為大規模生產符合GMP規范的臨床級外泌體。

背景技術

GMP是一套適用于制藥、食品等行業的強制性標準，要求企業從原料、人員、設施設備、生產過程、包裝運輸、質量控制等方面按國家有關法規達到衛生質量要求，形成一套可操作的作業規范幫助企業改善企業衛生環境，及時發現生產過程中存在的問題，加以改善，簡要的說，GMP要求制藥、食品等生產企業應具備良好的生產設備，合理的生產過程，完善的質量管理和嚴格的檢測系統，確保最終產品質量(包括食品安全衛生等)符合法規要求。

GMP級關節液間充質干細胞源性外泌體是用于醫療治療中較好的外泌體，但它在實際制作的過程中仍存在以下弊端：

現有技術中，GMP級關節液間充質干細胞源性外泌體在生產的過程中存在穩定性較差，生物相容性較差，生物穩定性較差等現象；

且現有技術中，GMP級關節液間充質干細胞源性外泌體在生產時較為不便，生產步驟復雜，生產成本較高，不適合推廣。

為此，提出了大規模生產符合GMP規范的臨床級外泌體以解決上述弊端。

發明內容

本發明的目的在于提供大規模生產符合GMP規范的臨床級外泌體，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：大規模生產符合GMP規范的臨床級外泌體，該方法包括以下步驟：

S1：獲取細胞沉淀，首先抽取病人膝關節積液，離心獲得細胞沉淀，留取備用；

S2：培養間充質干細胞，在符合GMP的要求下利用無血清培養基對人關節來源的間充質干細胞進行培養，留取備用；

S3：生物反應器的預處理，將生物反應器清洗干凈，然后風干，留取備用；

S4：接種培養間充質干細胞，將人關節液來源的間充質干細胞接種到微載體上，進行三維(3D)細胞培養，生物反應器的外部培養瓶不間斷地提供細胞養分，細胞通過分子量截留膜和微載體保留于細胞生物反應室中；

S5：培養獲得外泌體，對S4中得到的上清液進行差異超速離心分離獲取外泌體，并進行洗滌步驟從培養上清液中富集純凈的外泌體。

優選的，所述步驟S2中，無血清培養基和試劑被廣泛的應用于培養哺乳動物和無脊椎動物細胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。

優選的，所述步驟S3中，生物反應器使用升降機型反應器，是指利用自然存在的微生物或具有特殊降解能力的微生物接種至液相或固相的反應系統。

優選的，所述步驟S5中，對S4中得到的上清液進行差異超速離心處理所使用的是離心機。

優選的，所述離心機的類型分為：過濾式離心機、沉降式離心機，在此所使用的是沉降式離心機。

優選的，所述步驟S2中，間充質干細胞從細胞沉淀中提取。

優選的，所述步驟S3中，生物反應器清洗10-15分鐘即可。