[發明專利]一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法

在審

• 申請號: 201910013336.4
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN109852576A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 施歌
• 申請（專利權）人: 施歌
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 李想

本發明屬于皮脂腺技術領域，公開了一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法，包括以下步驟：步驟(1)：分離皮脂腺：切取人的面部皮膚，去除皮下脂肪并剝離表皮層，分離得到皮脂腺；步驟(2)：培養皮脂腺細胞；步驟(3)：病毒培養液的制備：步驟(4)：SV40Tag轉染；步驟(5)：步驟(4)中的轉染細胞株連續傳至50代得穩定轉染細胞株，永生化皮脂腺細胞株構建成功。本發明的永生化皮脂腺細胞株的構建方法首次構建中國人永生化皮脂腺細胞株，可為亞洲人痤瘡治療藥物篩選提供了理想的細胞模型。

技術領域

本發明屬于皮脂腺技術領域，具體涉及一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法。

背景技術

正常人皮脂腺細胞只能原代培養3-6代，不能滿足大規模和長期皮脂腺細胞實驗的需要。1999年，Zouboulis等將人面部皮脂腺細胞轉染猿猴病毒40大T抗原(SV40Tag)，首次構建了德國人皮脂腺細胞株SZ95。2003年，Thiboutot等用同樣方法構建了美國人皮脂腺細胞株SEB-1。2008年，Lo Celso等通過轉染HPV16E6E7基因構建了英國人皮脂腺細胞株SebE6E7。目前應用較多的是SZ95和SEB-1細胞株，二者均保留了正常人皮脂腺主要特征，如合成脂質、表達皮脂腺標志物、發生凋亡、對雄激素和維A酸起作用。然而，這些細胞株不能完全分化，也會發生原位細胞溶解。Thiboutot等用基因芯片檢測了SEB-1細胞、正常人皮脂腺中脂質和類固醇代謝酶類，發現5個脂質代謝酶、7個類固醇代謝酶基因表達差異無顯著性。雖然SZ95和SebE6E7細胞來源于皮脂腺，但其具有雙潛能(皮脂腺和毛囊間表皮)分化能力。此外，近期還有學者發現綠茶提取物兒茶素沒食子酸酯(EGCG)可抑制IGF-1誘導的SZ95細胞脂質合成及促炎細胞因子(IL-1、IL-6、IL-8)產生，提示EGCG具有潛在的抗痤瘡作用。因此，皮脂腺細胞株不僅被廣泛用于研究皮脂腺生理及內分泌功能，而且用于探索皮脂腺相關疾病的發病機制和藥物開發。

為此，我們提出一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法，為亞洲人痤瘡治療藥物篩選提供了理想的細胞模型。

發明內容

為了解決現有技術存在的上述問題，本發明目的在于提供一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法。

本發明所采用的技術方案為：

一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法包括以下步驟：

步驟(1)：分離皮脂腺：切取人的面部皮膚，去除皮下脂肪并剝離表皮層，分離得到皮脂腺；

步驟(2)：培養皮脂腺細胞；

步驟(3)：病毒培養液的制備：將含有SV40Tag的細胞株置入細胞培養皿中培養，含有SV40Tag的細胞株的細胞長到95％時收集全部培養液，過濾后，得病毒培養液，在4℃下保存備用；

步驟(4)：SV40Tag轉染：將第二或第三代的皮脂腺細胞進行培養，待細胞長到80％時，先加入步驟(3)的病毒培養液轉染，再先后利用皮脂腺細胞培養液和含200μg/ml G418的皮脂腺細胞培養液培養，得轉染細胞株，開始第一次傳代，以后每72-96h傳代一次；

步驟(5)：步驟(4)中的轉染細胞株連續傳至50代得穩定轉染細胞株，永生化皮脂腺細胞株構建成功。

進一步地，一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法包括以下步驟：

步驟(1)：分離皮脂腺：切取人的面部皮膚，依次用PBS緩沖液及70％酒精清洗，再置于皮脂腺細胞培養液中，然后去除皮下脂肪，將皮膚切成塊狀，加入中性蛋白酶，密封后放入溫度4℃以下過夜；體視顯微鏡下剝離表皮層，分離得皮脂腺；

步驟(2)：培養皮脂腺細胞：分離的皮脂腺置于具有膠原涂層的細胞培養皿中，將細胞培養皿放入5％CO2細胞培養箱內在37℃下靜置培養48-72h，每48-72h更換一次皮脂腺細胞培養液，待皮脂腺細胞長滿后傳代；