[發明專利]一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法

在審

• 申請號: 201910013336.4
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN109852576A
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發明（設計）人: 施歌
• 申請（專利權）人: 施歌
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 李想

1.一種永生化皮脂腺細胞株的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟(1)：分離皮脂腺：切取人的面部皮膚，去除皮下脂肪并剝離表皮層，分離得到皮脂腺；

步驟(2)：培養皮脂腺細胞；

步驟(3)：病毒培養液的制備：將含有SV40Tag的細胞株置入細胞培養皿中培養，含有SV40Tag的細胞株的細胞長到95％時收集全部培養液，過濾后，得病毒培養液，在4℃下保存備用；

步驟(4)：SV40Tag轉染：將第二或第三代的皮脂腺細胞進行培養，待細胞長到80％時，先加入步驟(3)的病毒培養液轉染，再先后利用皮脂腺細胞培養液和含200μg/ml G418的皮脂腺細胞培養液培養，得轉染細胞株，開始第一次傳代，以后每72-96h傳代一次；

步驟(5)：步驟(4)中的轉染細胞株連續傳至50代得穩定轉染細胞株，永生化皮脂腺細胞株構建成功。

2.根據權利要求1所述的永生化皮脂腺細胞株的構建方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟(1)：分離皮脂腺：切取人的面部皮膚，依次用PBS緩沖液及70％酒精清洗，再置于皮脂腺細胞培養液中，然后去除皮下脂肪，將皮膚切成塊狀，加入中性蛋白酶，密封后放入溫度4℃以下過夜；體視顯微鏡下剝離表皮層，分離得皮脂腺；

步驟(2)：培養皮脂腺細胞：分離的皮脂腺置于具有膠原涂層的細胞培養皿中，將細胞培養皿放入5％CO₂細胞培養箱內在37℃下靜置培養48-72h，每48-72h更換一次皮脂腺細胞培養液，待皮脂腺細胞長滿后傳代；

步驟(3)：病毒培養液的制備：將含有SV40Tag的細胞株置入細胞培養皿中，向細胞培養皿中加入DMEM培養液，在5％CO₂細胞培養箱內于37℃下靜置培養48h以上，細胞長到95％時收集全部培養液，過濾后，得病毒培養液，在4℃下保存備用；

步驟(4)：SV40Tag轉染：將第二或第三代的皮脂腺細胞置入細胞培養皿中，向細胞培養皿中加入皮脂腺細胞培養液，在5％CO₂細胞培養箱內于37℃下培養，待細胞長到80％時，加入病毒培養液轉染6h-8h，棄掉皮脂腺細胞培養液及病毒培養液，用PBS緩沖液沖洗后，再加入皮脂腺細胞培養液繼續培養48h以上；再加入含200μg/ml G418的皮脂腺細胞培養液，此后每24h更換一次上述含200μg/ml G418的皮脂腺細胞培養液，連續更換2次，待細胞長到90％時，得轉染細胞株，開始第一次傳代，以后每72-96h傳代一次；

步驟(5)：步驟(4)中的轉染細胞株連續傳至50代得穩定轉染細胞株，永生化皮脂腺細胞株構建成功。

3.根據權利要求2所述的永生化皮脂腺細胞株的構建方法，其特征在于：皮脂腺細胞培養液的配制過程為：向500ml的培養液中加入體積百分比為2％-10％的胎牛血清、體積百分比為1-2％的抗菌劑及濃度為0-10ng/ml的重組人EGF。

4.根據權利要求3所述的永生化皮脂腺細胞株的構建方法，其特征在于：步驟(2)中，細胞培養皿的內徑為6cm，細胞培養皿內的皮脂腺細胞培養液的體積不超過1.5ml。

5.根據權利要求4所述的永生化皮脂腺細胞株的構建方法，其特征在于：步驟(1)中，塊狀的尺寸為0.5cm×0.5cm。

6.根據權利要求5所述的永生化皮脂腺細胞株的構建方法，其特征在于：步驟(3)中，DMEM培養液的配制過程為：向500ml的培養液中加入體積百分比為10％的胎牛血清及體積百分比為1％的抗菌劑。

7.根據權利要求6所述的永生化皮脂腺細胞株的構建方法，其特征在于：步驟(3)中，通過濾孔孔徑為0.22μm的針孔過濾器過濾。

8.根據權利要求2-7任一項權利要求所述的永生化皮脂腺細胞株的構建方法，其特征在于：步驟(4)中，病毒培養液的轉染時間為6h。