[發(fā)明專利]一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒及制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910012903.4
• 申請(qǐng)日: 2019-01-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110205304A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬茜;汪洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安彤盛生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/01;C12N15/863;C12N15/39;C12N15/54;A61K35/768;A61K39/385;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 西安弘理專利事務(wù)所 61214
• 代理人: 韓玙

1.一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，去除天壇株溶瘤痘苗病毒的VGF基因和TK基因，其中VGF基因的堿基序列如序列表1所示，TK基因的堿基序列如序列表2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，重組天壇株溶瘤痘苗病毒中插入EGFP基因，所述EGFP基因由啟動(dòng)子P7.5控制表達(dá)，所述EGFP基因由位于重組天壇株溶瘤痘苗病毒的VGF區(qū)，所述EGFP基因的核苷酸序列如序列表3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，重組天壇株溶瘤痘苗病毒中插入Luciferase報(bào)告基因和mCherry基因，所述Luciferase報(bào)告基因和mCherry基因由啟動(dòng)子P7.5控制表達(dá)，所述Luciferase報(bào)告基因和mCherry基因位于重組天壇株溶瘤痘苗病毒的TK區(qū)，所述Luciferase報(bào)告基因和mCherry基因的核苷酸序列如序列表4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，重組天壇株溶瘤痘苗病毒的出發(fā)病毒為天壇株。

5.一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，具體按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1，將針對(duì)VTT病毒VGF基因的打靶質(zhì)粒與VTT病毒在細(xì)胞內(nèi)重組，收集重組病毒；

步驟2，篩選純化重組病毒，得到去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒；

步驟3，將去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒與針對(duì)VTT病毒TK基因的打靶質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)重組，再次收集重組病毒懸液；

步驟4，將步驟3的重組病毒懸液進(jìn)行篩選純化，得到去除VGF和TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，所述步驟1具體按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1.1，以T25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)CV-1單層細(xì)胞至80％覆蓋；

步驟1.2，取野生型VTT病毒以0.05MOI感染CV-1細(xì)胞，并在37℃的溫度下培養(yǎng)2小時(shí)，得到感染VTT的CV-1細(xì)胞；

步驟1.3，去除上清液，將針對(duì)VTT病毒VGF基因的打靶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至感染VTT的CV-1細(xì)胞中，在37℃的溫度下培養(yǎng)4小時(shí)，更換一次新鮮培養(yǎng)基；

所述針對(duì)VTT病毒VGF基因的打靶質(zhì)粒包括pMV-VTTVGFE質(zhì)粒，所述pMV-VTTVGFE質(zhì)粒插入有痘苗病毒天壇株VGF基因的上游同源重組臂VTT-VGFL和下游同源重組臂VTT-VGFR，所述上游同源重組臂VTT-VGFL和下游同源重組臂VTT-VGFR間插入EGFP綠色熒光蛋白標(biāo)記基因，所述EGFP綠色熒光蛋白標(biāo)記基因由痘苗病毒啟動(dòng)子P7.5啟動(dòng)表達(dá)。

步驟1.4，將步驟1.3得到的CV-1細(xì)胞在培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)后，收集CV-1細(xì)胞，反復(fù)凍融三次，進(jìn)行超聲破碎，獲得病毒懸液，并將其保存于-80℃的溫度下。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，所述步驟2具體按照下述步驟進(jìn)行：

步驟2.1，用6孔板培養(yǎng)CV-1單層細(xì)胞至80％覆蓋；

步驟2.2，取步驟1得到的病毒懸液，做10倍倍比稀釋，取10^-1，10^-2，10^-3稀釋度的病毒懸液感染CV-1細(xì)胞，在37℃培養(yǎng)2小時(shí)；

步驟2.3，在步驟2.2處理后的6孔板的每孔覆蓋2～3ml瓊脂DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)3天；

步驟2.4，將經(jīng)過(guò)步驟2.3處理后的6孔板在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)，挑取孤立的有綠色熒光的病毒噬斑進(jìn)行連續(xù)單斑純化，約經(jīng)6次純化即可獲得去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒。