[發(fā)明專利]一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒及制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910012903.4
• 申請(qǐng)日: 2019-01-07
• 公開（公告）號(hào): CN110205304A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬茜;汪洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安彤盛生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/00
• 分類號(hào): C12N7/00;C12N7/01;C12N15/863;C12N15/39;C12N15/54;A61K35/768;A61K39/385;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 西安弘理專利事務(wù)所 61214
• 代理人: 韓玙

本發(fā)明公開了一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒，去除天壇株溶瘤痘苗病毒的VGF基因和TK基因，其中VGF基因的堿基序列如序列表1所示，TK基因的堿基序列如序列表2所示。本發(fā)明還公開了該重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒VTT?DD?Luc，降低了天壇株溶瘤痘苗病毒的毒性，提高了天壇株溶瘤痘苗病毒的腫瘤選擇性，外源基因Luciferase報(bào)告基因表達(dá)可用于分析溶瘤痘苗病毒在體內(nèi)的分布情況，尤其在腫瘤中的分布研究。本發(fā)明可用于研發(fā)活疫苗，可治療肝癌、肺癌、黑色素瘤等多種腫瘤，為臨床提供新型抗腫瘤藥物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程及生物技術(shù)治療腫瘤藥物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒，具體為一種去除VGF和TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，本發(fā)明還涉及一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，具體為一種去除VGF和TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法。

背景技術(shù)

腫瘤生物治療技術(shù)是近年來興起的一種全新的腫瘤治療手段，具有副作用小、抗腫瘤活性高、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)。

痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)作為溶瘤病毒對(duì)腫瘤具有天然的趨向性，可選擇性的感染腫瘤細(xì)胞，并在其內(nèi)復(fù)制，不會(huì)被免疫系統(tǒng)很快清除。痘苗病毒天壇株(TianTan strain,VTT)是我國(guó)特有的一株痘苗病毒，為了進(jìn)一步提高VTT對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，需要對(duì)VTT進(jìn)行一定的改造。病毒生長(zhǎng)因子(virus growth factor,VGF)是一種與表皮生長(zhǎng)因子同源的分泌型蛋白，可與細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，這對(duì)病毒在正常組織中復(fù)制具有重要意義，但在腫瘤細(xì)胞中卻可有可無。胸苷激酶(Thymidinekinase，TK)為病毒DNA復(fù)制提供高水平的核苷酸池，正常細(xì)胞中TK濃度較低，去除病毒TK基因使病毒更傾向于在DNA代謝旺盛、有高濃度TK和核苷酸池的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并殺死腫瘤細(xì)胞，這已在包括結(jié)腸癌、黑素瘤、肉瘤等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中得到證實(shí)。因此，去除VTT的VGF和TK基因可增強(qiáng)病毒的腫瘤選擇性，提高病毒的安全性。目前尚缺乏VGF和TK基因雙敲且具有體內(nèi)示蹤能力的天壇株溶瘤病毒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒VTT-DD-Luc，去除了天壇株溶瘤痘苗病毒中的VGF和TK基因，能夠增強(qiáng)天壇株溶瘤痘苗病毒的腫瘤選擇性，提高天壇株溶瘤痘苗病毒的安全性。

本發(fā)明還提供了上述重組天壇株溶瘤痘苗病毒VTT-DD-Luc的制備方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒，去除天壇株溶瘤痘苗病毒的VGF基因和TK基因，其中VGF基因的堿基序列如序列表1所示，TK基因的堿基序列如序列表2所示。

本發(fā)明采用的第一種技術(shù)方案的特點(diǎn)還在于：

重組天壇株溶瘤痘苗病毒中插入EGFP基因，EGFP基因由啟動(dòng)子P7.5控制表達(dá)，EGFP基因由位于重組天壇株溶瘤痘苗病毒的VGF區(qū)，EGFP基因的核苷酸序列如序列表3所示。

重組天壇株溶瘤痘苗病毒中插入Luciferase報(bào)告基因和mCherry基因，Luciferase報(bào)告基因和mCherry基因由啟動(dòng)子P7.5控制表達(dá)，Luciferase報(bào)告基因和mCherry基因位于重組天壇株溶瘤痘苗病毒的TK區(qū)，Luciferase報(bào)告基因和mCherry基因的核苷酸序列如序列表4所示。

重組天壇株溶瘤痘苗病毒的出發(fā)病毒為天壇株。

本發(fā)明采用的另一種技術(shù)方案是：

一種重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，具體按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1，將針對(duì)VTT病毒VGF基因的打靶質(zhì)粒與VTT病毒在細(xì)胞內(nèi)重組，收集重組病毒；

步驟2，篩選純化重組病毒，得到去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒；