[發明專利]去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒及制備和應用

在審

• 申請號: 201910012884.5
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN110205307A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 馬茜;汪洋
• 申請（專利權）人: 西安彤盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12N15/90;C12N15/65;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 韓玙

本發明公開了一種去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，去除天壇株溶瘤痘苗病毒VGF基因，表達EGFP基因，其中VGF基因的堿基序列如序列表1所示。本發明還公開了該去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法及應用。本發明去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒VTT?VGFE，降低了天壇株溶瘤痘苗病毒的毒性，提高了天壇株溶瘤痘苗病毒的腫瘤選擇性，且具有實時監測病毒顆粒在體內分布的功能，為痘苗病毒作為載體研發活疫苗及腫瘤生物治療提供了良好工具，能夠適用于治療肺癌、肝癌、黑色素瘤等多種腫瘤。

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及一種去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，本發明還涉及一種去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法和應用。

背景技術

腫瘤生物治療技術是近年來興起的一種全新的腫瘤治療手段，具有副作用小、抗腫瘤活性高、適應性廣等特點。

痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)作為溶瘤病毒對腫瘤具有天然的趨向性，可選擇性的感染腫瘤細胞，并在其內復制，不會被免疫系統很快清除。痘苗病毒天壇株(TianTan strain,VTT)是我國特有的一株痘苗病毒，作為人類預防天花的疫苗，曾經在全世界范圍內普遍使用，因此痘苗病毒為癌癥治療提供了新的方向。為了進一步提高痘苗病毒對腫瘤細胞的選擇性，需要對病毒進行一定的改造。病毒生長因子(virus growth factor,VGF)是一種與表皮生長因子同源的分泌型蛋白，可與細胞表面的表皮生長因子受體結合從而促進細胞增殖，這對病毒在正常組織中復制具有重要意義，但在腫瘤細胞中卻可有可無，去除VTT的VGF基因可增強腫瘤選擇性，提高病毒安全性。但是目前尚缺乏去除VGF基因的減毒天壇株病毒。

發明內容

本發明的目的是提供一種去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒VTT-VGFE，能夠降低天壇株溶瘤痘苗病毒的毒性，提高天壇株溶瘤痘苗病毒的腫瘤選擇性。

本發明還提供了去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法。

及應用

本發明所采用的技術方案是，去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，去除天壇株溶瘤痘苗病毒VGF基因，其中VGF基因的堿基序列如序列表1所示。

本發明采用的第一種技術方案的特點在于：

重組天壇株溶瘤痘苗病毒中插入了綠色熒光蛋白基因EGFP，綠色熒光蛋白基因EGFP由啟動子子P7.5控制表達，綠色熒光蛋白基因EGFP位于重組天壇株溶瘤痘苗病毒的VGF區，綠色熒光蛋白基因EGFP的堿基序列如序列表2所示。

重組天壇株溶瘤痘苗病毒的出發病毒為天壇株。

本發明采用的另一種技術方案是：

去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，具體按照下述步驟進行：

步驟1，將針對VTT病毒VGF基因的打靶質粒與VTT病毒在細胞內重組后，收集病毒；

步驟2，篩選純化重組病毒，得到去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒。

本發明另一種技術方案的特點還在于：

步驟1中針對VTT病毒VGF基因的打靶質粒為pMV-VTTVGFE，打靶質粒pMV-VTTVGFE含有出發載體pMV-Pro、痘苗病毒天壇株VGF基因的上游同源重組臂VTT-VGFL和下游同源重組臂VTT-VGFR，在VTT-VGFL與VTT-VGFR之間有熒光標記基因EGFP和1個多克隆位點，其中熒光標記基因EGFP由啟動子P7.5控制表達，多克隆位點處包含啟動子P11。

步驟1具體按照下述步驟進行：

步驟1.1，在T25細胞培養瓶中培養CV-1單層細胞，至70～80％覆蓋；