[發明專利]去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒及制備和應用

在審

• 申請號: 201910012884.5
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN110205307A
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 馬茜;汪洋
• 申請（專利權）人: 西安彤盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12N15/90;C12N15/65;A61P35/00;C12R1/93
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 韓玙

1.去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，去除天壇株溶瘤痘苗病毒VGF基因，其中VGF基因的堿基序列如序列表1所示。

2.根據權利要求1所述的去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，所述重組天壇株溶瘤痘苗病毒中插入了綠色熒光蛋白基因EGFP，所述綠色熒光蛋白基因EGFP由啟動子P7.5控制表達，所述綠色熒光蛋白基因EGFP位于重組天壇株溶瘤痘苗病毒的VGF區，所述綠色熒光蛋白基因EGFP的堿基序列如序列表2所示。

3.根據權利要求1所述的去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，所述重組天壇株溶瘤痘苗病毒的出發病毒為天壇株。

4.去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，具體按照下述步驟進行：

步驟1，將針對VTT病毒VGF基因的打靶質粒與VTT病毒在細胞內重組后，收集病毒；

步驟2，篩選純化重組病毒，得到去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒。

5.根據權利要求4所述的去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，所述步驟1中針對VTT病毒VGF基因的打靶質粒為pMV-VTTVGFE，所述打靶質粒pMV-VTTVGFE含有出發載體pMV-Pro、痘苗病毒天壇株VGF基因的上游同源重組臂VTT-VGFL和下游同源重組臂VTT-VGFR，在VTT-VGFL與VTT-VGFR之間有熒光標記基因EGFP和1個多克隆位點，其中熒光標記基因EGFP由啟動子P7.5控制表達，多克隆位點處包含啟動子P11。

6.根據權利要求4的去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，所述步驟1具體按照下述步驟進行：

步驟1.1，在T25細胞培養瓶中培養CV-1單層細胞，至70～80％覆蓋；

步驟1.2，用VTT病毒感染CV-1細胞，在37℃的溫度下培養2～3小時；

步驟1.3，將針對VTT病毒VGF基因的打靶質粒轉染至感染了VTT病毒的CV-1細胞，培養3～5小時后，更換一次培養基；

步驟1.4，將步驟1.3得到的CV-1細胞在培養箱繼續培養48小時后，收集CV-1細胞，反復凍融三次，進行超聲破碎，獲得病毒懸液，并將其保存于-80℃的溫度下。

7.根據權利要求4述的去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，所述步驟2具體按照下述步驟進行：

步驟2.1，在6孔板中培養CV-1細胞，至70～80％覆蓋；

步驟2.2，將步驟1收集的病毒懸液，做10倍倍比稀釋后感染CV-1細胞，在37℃培養2～3小時；

步驟2.3，在步驟2.2處理后的六孔板的每孔覆蓋2～3ml瓊脂DMEM培養基，培養2～3天；

步驟2.4，將經過步驟2.3處理后的6孔板在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達，挑取孤立的有綠色熒光的病毒噬斑進行連續單斑純化，直至病毒純化，得到去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒。

8.去除VGF基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒作為疫苗、生物載體和抗腫瘤藥物的應用。