[發(fā)明專利]去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒及其制備和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910012869.0
• 申請(qǐng)日: 2019-01-07
• 公開（公告）號(hào): CN109810953A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 馬茜;汪洋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西安彤盛生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N15/63;C12N15/90;C12N15/65;A61P35/00
• 代理公司: 西安弘理專利事務(wù)所 61214
• 代理人: 韓玙

本發(fā)明公開了一種去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，對(duì)天壇株溶瘤痘苗病毒進(jìn)行重組改造，去除TK基因，表達(dá)EGFP基因和Luciferase基因。本發(fā)明還公開了一種去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，包括將野生型VTT病毒與針對(duì)VTT病毒TK基因的打靶質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)重組，得到病毒懸液；篩選純化重組病毒懸液得到減毒天壇株溶瘤痘苗病毒的步驟。本發(fā)明的去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，以胸苷激酶TK基因作為減毒目標(biāo)，表達(dá)EGFP基因和Luciferase基因，降低了病毒毒性，提高了病毒的腫瘤選擇性，且具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病毒顆粒在體內(nèi)分布的功能，為臨床提供了新型抗腫瘤藥物，可用于研發(fā)活疫苗，適用于治療肺癌、肝癌、黑色素瘤等多種腫瘤。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，本發(fā)明還涉及一種去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤生物治療技術(shù)是近年來(lái)興起的一種全新的腫瘤治療手段，具有副作用小、抗腫瘤活性高、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)。

痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)作為溶瘤病毒對(duì)腫瘤具有天然的趨向性，可選擇性的感染腫瘤細(xì)胞，并在其內(nèi)復(fù)制，不會(huì)被免疫系統(tǒng)很快清除。痘苗病毒天壇株(TianTan strain,VTT)是我國(guó)特有的一株痘苗病毒，為了進(jìn)一步提高VTT對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，需要對(duì)VTT進(jìn)行一定的改造。胸苷激酶(Thymidine kinase，TK)為病毒DNA復(fù)制提供高水平的核苷酸池，正常細(xì)胞中TK濃度較低，去除病毒TK基因使病毒更傾向于在DNA代謝旺盛、有高濃度TK和核苷酸池的腫瘤細(xì)胞中復(fù)制，并殺傷腫瘤細(xì)胞，這已在包括結(jié)腸癌、黑素瘤、肉瘤等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中得到證實(shí)。目前尚缺乏去除TK基因且具有體內(nèi)示蹤能力的天壇株溶瘤病毒。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種去除TK基因的具有示蹤能力的重組天壇株溶瘤痘苗病毒VTT-TK-ELuc，能夠降低天壇株溶瘤痘苗病毒的毒性，提高天壇株溶瘤痘苗病毒的腫瘤選擇性。

本發(fā)明還提供了一種去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，對(duì)天壇株溶瘤痘苗病毒進(jìn)行重組改造，去除TK基因，其中TK基因的核苷酸序列如序列表1所示。

本發(fā)明的特點(diǎn)還在于：

在減毒天壇株溶瘤痘苗病毒插入EGFP綠色熒光蛋白基因和Luciferase報(bào)告基因，EGFP綠色熒光蛋白基因和Luciferase報(bào)告基因由啟動(dòng)子P7.5控制表達(dá)，EGFP綠色熒光蛋白基因和Luciferase報(bào)告基因位于減毒天壇株溶瘤痘苗病毒的TK區(qū)，EGFP綠色熒光蛋白基因和Luciferase報(bào)告基因的堿基序列如序列表2所示。

重組天壇株溶瘤痘苗病毒的出發(fā)病毒是天壇株。

本發(fā)明采用的另一種技術(shù)方案是：

去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，具體按照下述步驟進(jìn)行：

步驟1，將野生型VTT病毒與針對(duì)VTT病毒TK基因的打靶質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)重組，得到病毒；

步驟2，篩選純化重組病毒懸液得到重組天壇株溶瘤痘苗病毒。

本發(fā)明另一種技術(shù)方案的特點(diǎn)還在于：

針對(duì)VTT病毒TK基因的打靶質(zhì)粒為pMV-VTTTK-ELuc質(zhì)粒，pMV-VTTTK-ELuc質(zhì)粒插入有痘苗病毒天壇株TK基因的上游同源重組臂VTT-TKL和下游同源重組臂VTT-TKR，上游同源重組臂VTT-TKL和下游同源重組臂VTT-TKR間插入EGFP綠色熒光蛋白標(biāo)記基因和Luciferase報(bào)告基因，EGFP綠色熒光蛋白標(biāo)記基因和Luciferase報(bào)告基因均由痘苗病毒啟動(dòng)子P7.5啟動(dòng)表達(dá)。