[發明專利]去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒及其制備和應用

在審

• 申請號: 201910012869.0
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN109810953A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 馬茜;汪洋
• 申請（專利權）人: 西安彤盛生物科技有限公司
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/63;C12N15/90;C12N15/65;A61P35/00
• 代理公司: 西安弘理專利事務所 61214
• 代理人: 韓玙

1.去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，對天壇株溶瘤痘苗病毒進行重組改造，去除TK基因，其中TK基因的核苷酸序列如序列表1所示。

2.根據權利要求1所述的去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，在減毒天壇株溶瘤痘苗病毒插入EGFP綠色熒光蛋白基因和Luciferase報告基因，所述EGFP綠色熒光蛋白基因和Luciferase報告基因由啟動子P7.5控制表達，所述EGFP綠色熒光蛋白基因和Luciferase報告基因位于減毒天壇株溶瘤痘苗病毒的TK區，所述EGFP綠色熒光蛋白基因和Luciferase報告基因的堿基序列如序列表2所示。

3.根據權利要求1所述的去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒，其特征在于，所述重組天壇株溶瘤痘苗病毒的出發病毒是天壇株。

4.去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，具體按照下述步驟進行：

步驟1，將野生型VTT病毒與針對VTT病毒TK基因的打靶質粒在細胞內重組，得到病毒；

步驟2，篩選重組純化病毒懸液得到減毒天壇株溶瘤痘苗病毒。

5.根據權利要求4所述的去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，所述針對VTT病毒TK基因的打靶質粒為pMV-VTTTK-ELuc質粒，所述pMV-VTTTK-ELuc質粒插入有痘苗病毒天壇株TK基因的上游同源重組臂VTT-TKL和下游同源重組臂VTT-TKR，所述上游同源重組臂VTT-TKL和下游同源重組臂VTT-TKR間插入EGFP綠色熒光蛋白標記基因和Luciferase報告基因，所述EGFP綠色熒光蛋白標記基因和Luciferase報告基因均由痘苗病毒啟動子P7.5啟動表達。

6.根據權利要求4所述的去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，所述步驟1具體按照下述步驟進行：

步驟1.1，以T25培養瓶培養CV-1單層細胞至80％覆蓋；

步驟1.2，取野生型VTT病毒以0.05MOI感染CV-1細胞，并在37℃的溫度下培養2小時，得到感染VTT的CV-1細胞；

步驟1.3，去除上清液，將針對VTT病毒VGF基因的打靶質粒轉染至感染VTT的CV-1細胞中，在37℃的溫度下培養4小時，之后更換一次新鮮培養基；

步驟1.4，將步驟1.3得到的CV-1細胞在培養箱繼續培養48小時后，收集CV-1細胞，反復凍融三次，進行超聲破碎，獲得病毒懸液，并將其保存于-80℃的溫度下。

7.根據權利要求4所述的去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒的制備方法，其特征在于，所述步驟2具體按照下述步驟進行：

步驟2.1，用6孔板培養HuTK^-143B單層細胞至80％覆蓋；

步驟2.2，取步驟1得到的病毒懸液，做10倍倍比稀釋，取10^-1，10^-2，10^-3稀釋度的病毒懸液感染HuTK^-143B細胞，在37培養2小時；

步驟2.3，在步驟2.2處理后的6孔板的每孔覆蓋2ml含50ug/ml BrdU的瓊脂MEM培養基，培養3天；

步驟2.4，將經過步驟2.3處理后的6孔板在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達，挑取孤立的有綠色熒光的病毒噬斑進行連續單斑純化，約經6次純化即可獲得重組天壇株溶瘤痘苗病毒。

8.去除TK基因的重組天壇株溶瘤痘苗病毒作為疫苗、生物載體和抗腫瘤藥物的應用。