[發明專利]檢測樣本中BAALC基因相對表達量的引物、探針及方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201910011711.1
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN109652510A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 王淑一;吳鵬飛
• 申請（專利權）人: 福州艾迪康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 黎雙華

本發明公開用于檢測樣本中BAALC基因的寡核苷酸、方法和試劑盒，其包括針對BAALC的上下游引物和探針，以及針對ABL內參基因的上下游引物和探針。本發明可快速檢測樣本中是否存在BAALC基因及其表達量的多少。利用本發明完成的檢測結果準確且靈敏，可為人類急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)輔助制定個體化治療方案和疾病預后判斷。

技術領域

本發明屬于生物科學和生物技術領域，特別涉及一種檢測樣本中BAALC基因的方法、引物、探針和試劑盒，采用熒光PCR技術，檢測人類急性髓系白血病(Acute MyeloidLeukemia，AML)患者體內BAALC基因的表達水平。

背景技術

急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是最常見的白血病類型，主要由于白血病干細胞克隆性增殖，致骨髓正常造血功能受到抑制所致。AML診斷時存在的細胞遺傳學異常是預測疾病預后的重要依據。近年來，采用分子遺傳學來評價AML患者的預后，其中包括基因的異常表達和突變。BAALC(Brain And Acute Leukemia，Cytoplasmic)基因位于8q22.3，最早在神經外胚層組織中發現其表達。Tanner等于2001年在造血前體細胞中亦發現BAALC的表達。研究報道BAALC在AML患者中呈過表達，且其過表達是正常核型急性髓系白血病(AML with normal cytogenetics，CN-AML)患者預后不良的影響因素。國內亦有一些文獻報道BAALC過表達的臨床意義，然而其結果不盡相同。本研究應用實時定量PCR(real—time quantitative PCR，RQ-PCR)方法檢測中國人群AML患者中BAALC的表達情況，并對其臨床意義進行探討。

BAALC基因定位于染色體8q22.3，編碼一種與任何已知蛋白或功能域均無同源性的蛋白質。BAALC主要表達于神經外胚層來源組織和造血前體細胞，成熟的骨髓和外周血單核細胞不表達。AML、急性淋巴細胞自血病(acute lymphocytic leukemia。ALL)及CML急變期有BAALC基因的高表達，而CML慢性期及CLL則檢測不到。自2001年Stephan等發現部分AML、ALL患者存在BAALC基因的過表達。且BAALC基因的過表達與AML患者的不良預后相關以來.研究BAALC基岡在AML中的表達水平及其與預后的關系成為近來的熱點。定性RT—PCR，不利于觀察基因表達水平。RQ—PCR具有可定量、敏感度高等優點，目前已經成為檢測病毒和腫瘤基因表達的一個主要手段。

隨著技術的進步，定量PCR技術已廣泛應用于基因表達水平的研究。其中實時定量PCR是目前公認的最準確，重復性最好的定量PCR研究方法。其通過對PCR擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時監測從而實現對起始模板定量及定性的分析，優點如下：l、特異性強，靈敏度高；2、封閉反應，無需PCR后處理；3、定量范圍寬，可達到l0個數量級；4、采用對數期分析，摒棄終點數據，定量準確；5、儀器在線式實時檢測，結果直觀，避免人為判斷；6、可實現一管雙檢或多檢；7、操作安全，縮短時間，提高效率。已成功用于腫瘤基因表達量的研究。常見的方法有SYBR GreenI染料法,雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBRGreenI由于是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本研究采用實時熒光PCR技術結合Taqman探針法應用于BAALC基因檢測。

發明內容

本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，采用熒光定量PCR技術，利用雙標準曲線的方法，分別構建內參基因ABL和目的基因BAALC的定量標準曲線，檢測目的基因BAALC相對于內參基因ABL的表達水平。通過調整目的基因和內參基因的引物探針比例，以及PCR反應條件，使擴增效率和速率均達到最佳，從而能夠滿足BAALC基因的檢測，用于評價治療效果、預測預后。

用于BAALC基因相對表達量的引物和探針，其特征在于，所述引物和探針包括：