[發明專利]一種目的基因轉化原生質體的方法

在審

• 申請號: 201910010502.5
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN109554329A
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發明（設計）人: 李青竹;許俊旭;張永春;楊柳燕;孫翊;李心;王楨;周曉慧;楊貞
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務所(普通合伙) 31287
• 代理人: 張竹梅

本發明提供一種原生質體的提取方法，該方法包括如下步驟：(1)原材料處理；(2)酶解釋放原生質體；(3)原生質體的純化。本發明的原生質體提取方法獲得的原生質體可用于目的基因轉化原生質體，為重要候選基因分析和遺傳轉化提供了技術支持，為生物工程進行種質利用和改良奠定基礎，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及植物原生質體技術領域，具體的說涉及一種目的基因轉化原生質體的方法。

背景技術

石蒜屬(Lycoris spp.)和朱頂紅屬(Hippeastrum spp.)是石蒜科(Amaryllidaceae)球根草本植物，花型豐富，花色艷麗，觀賞價值極高，可以用作布置花境、假山、巖石園和做林下地被的良好材料。同時也具有藥用功能，富含多種石蒜科植物特有的生物堿成分。水仙環素具有抗腫瘤的活性，石蒜堿可以誘發癌細胞系HL-60的細胞凋亡，加蘭他敏和力可拉敏，是臨床治療阿爾茨海默癥的首選藥物之一。植物本身生長緩慢加上對資源的掠奪式開發，使植物資源日益減少，因此迫切需要利用生物技術對現有資源進行開發和保護、利用遺傳轉化的方法創制新的種質資源。

植物原生質體可以在較短時間內獲得大量遺傳上具有同質性的細胞，也是植物遺傳轉化的良好受體材料，對基因功能研究意義重大；原生質體含有個體的全部遺傳信息，并可以產生重要次生代謝產物，對其進行分離提取檢測，可以為代謝物生產提供新思路；原生質體還被廣泛應用于基因亞細胞定位，體細胞遠源雜交，能夠克服雜交障礙，是種質創新的有效途徑。

國內外研究未見石蒜科植物幼苗原生質體分離和瞬時轉化方法及應用的報道。

發明內容

本發明首先提供了一種原生質體的提取方法，該方法包括如下步驟：

(1)原材料處理：將石蒜科植物幼苗，黑暗處理10-12h后，將幼苗葉片切為碎片；

(2)酶解釋放原生質體：將步驟(1)中得到的碎片放入試劑A中，溫度22-28℃，震蕩處理1-6h，得到混合溶液；

(3)原生質體的純化：將步驟(2)獲得的混合溶液用40-50μm濾網進行過濾，收集濾液，濾液離心5-10min，離心溫度為4℃，收集沉淀；沉淀用試劑B清洗、離心，最后離心沉淀用試劑C懸浮，得到原生質體懸浮液；

其中所述的試劑A為：Cellulase R10：0.05-0.5g、Macerozyme R10：0.01-0.5g、Mannitol：1-10g、MES：0.01-1.0g、CaCl₂：0.01-1.0g、H₂O：補足20ml體積；

試劑B為：NaCl：0.45-4.5g、CaCl₂：0.5-6.0g、KCl：0.01-1.0g、MES：0.02-2.0g、H₂O：補足100ml體積；

試劑C為：Mannitol：0.5-5.0g、MgCl₂·6H2O：0.01-1.0g、MES：0.001-0.1g、H₂O：補足10ml體積。

本發明還提供了上述原生質體提取方法得到的原生質體。

本發明還提供了一種目的基因轉化上述原生質體的方法，該方法為：

在原生質體懸浮液中，依次加入目的基因質粒載體和試劑D，室溫暗培養10-30min后，實現目的基因的轉化；

其中試劑D為：PEG4000：0.1-0.5g、Mannitol：0.01-0.15g、CaCl₂：0.0012-0.12g、H₂O：補足1ml體積。

具體的說，本發明提供了一種目的基因轉化原生質體的方法，該方法包括如下步驟：