[發(fā)明專利]一種目的基因轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201910010502.5
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN109554329A
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李青竹;許俊旭;張永春;楊柳燕;孫翊;李心;王楨;周曉慧;楊貞
• 申請（專利權(quán)）人: 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12N15/82
• 代理公司: 上海容慧專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31287
• 代理人: 張竹梅

1.一種原生質(zhì)體的提取方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

(1)原材料處理：將石蒜科植物幼苗，黑暗處理10-12h后，將幼苗葉片切為碎片；

(2)酶解釋放原生質(zhì)體：將步驟(1)中得到的碎片放入試劑A中，溫度22-28℃，震蕩處理1-6h，得到混合溶液；

(3)原生質(zhì)體的純化：將步驟(2)獲得的混合溶液用40-50μm濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集濾液，濾液離心5-10min，離心溫度為4℃，收集沉淀；沉淀用試劑B清洗、離心，最后離心沉淀用試劑C懸浮，得到原生質(zhì)體懸浮液；

其中所述的試劑A為：Cellulase R10：0.05-0.5g、Macerozyme R10：0.01-0.5g、Mannitol：1-10g、MES：0.01-1.0g、CaCl₂：0.01-1.0g、H₂O：補(bǔ)足20ml體積；

試劑B為：NaCl：0.45-4.5g、CaCl₂：0.5-6.0g、KCl：0.01-1.0g、MES：0.02-2.0g、H₂O：補(bǔ)足100ml體積；

試劑C為：Mannitol：0.5-5.0g、MgCl₂·6H2O：0.01-1.0g、MES：0.001-0.1g、H₂O：補(bǔ)足10ml體積。

2.權(quán)利要求1所述提取方法得到的原生質(zhì)體。

3.一種目的基因轉(zhuǎn)化權(quán)利要求2所述原生質(zhì)體的方法，其特征在于該方法為：

在原生質(zhì)體懸浮液中，依次加入目的基因質(zhì)粒載體和試劑D，室溫暗培養(yǎng)10-30min后，實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化；

其中試劑D為：PEG4000：0.1-0.5g、Mannitol：0.01-0.15g、CaCl₂：0.0012-0.12g、H₂O：補(bǔ)足1ml體積。

4.一種目的基因轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

(1)原材料處理：將石蒜科植物幼苗，黑暗處理10-12h后，將幼苗葉片切為碎片；

(2)酶解釋放原生質(zhì)體：將步驟(1)中得到的碎片放入試劑A中，溫度22-28℃，震蕩處理1-6h，得到混合溶液；

(3)原生質(zhì)體的純化：將步驟(2)獲得的混合溶液用40-50μm濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集濾液，濾液離心5-10min，離心溫度為4℃，收集沉淀；沉淀用試劑B清洗、離心，最后離心沉淀用試劑C懸浮，得到原生質(zhì)體懸浮液；

(4)目的基因的轉(zhuǎn)化：取步驟(3)獲得的原生質(zhì)體懸浮液，依次加入目的基因質(zhì)粒載體和試劑D，室溫暗培養(yǎng)10-30min后，實(shí)現(xiàn)目的基因的轉(zhuǎn)化；

其中所述的試劑A為：Cellulase R10：0.05-0.5g、Macerozyme R10：0.01-0.5g、Mannitol：1-10g、MES：0.01-1.0g、CaCl₂：0.01-1.0g、H₂O：補(bǔ)足20ml體積；

試劑B為：NaCl：0.45-4.5g、CaCl₂：0.5-6.0g、KCl：0.01-1.0g、MES：0.02-2.0g、H₂O：補(bǔ)足100ml體積；

試劑C為：Mannitol：0.5-5.0g、MgCl₂·6H2O：0.01-1.0g、MES：0.001-0.1g、H₂O：補(bǔ)足10ml體積；

試劑D為：PEG4000：0.1-0.5g、Mannitol：0.01-0.15g、CaCl₂：0.0012-0.12g、H₂O：補(bǔ)足1ml體積。