[發明專利]一種可變剪接報告載體及其制備方法

在審

• 申請號: 201910008701.2
• 申請日: 2019-01-04
• 公開（公告）號: CN109679976A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 劉旭;鄭小曼;權富生;張涌
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發明公開了一種可變剪接報告載體，在報告基因表達載體pEGFP?C1的報告基因序列內插入兩段內含子序列intron1和intron2，intron1與intron2分別具有5’剪切位點，分支位點和3’剪切位點。并且公開了可變剪接報告載體的制備方法。根據RNA的剪接機制設計合成intron1和intron2，將intron1和intron2分別插入插入報告基因表達載體的報告序列，用以在細胞水平和活體水平檢測可變剪接事件，含有剪接位點的內含子的插入便于轉錄后mRNA的正確拼接。

技術領域

本發明涉及基因克隆技術領域，更具體的說是涉及一種可變剪接報告載體及其制備方法。

背景技術

可變剪接是基因表達的一種普遍調控機制，它能使單個基因產生多個不同種類的mRNA。可變剪接包括外顯子跳躍，外顯子互斥之間的選擇，剪接位點的利用和內含子保留等。通過可變剪接機制，可以產生在非翻譯區或編碼序列上存在差異的mRNA，這些差異可能影響mRNA的穩定、定位或者翻譯。此外，一些剪接mRNA亞型可以改變閱讀框，產生具有不同作用或定位的差異蛋白亞型。全基因組的研究預測90-95％的人類基因都會發生某種程度的可變剪接。高分辨質譜分析顯示在大約2萬個人類蛋白質編碼基因中，約有37％的產生多種蛋白亞型，表明可變剪接有利于蛋白質組的復雜化。

現已確定可變剪接有助于細胞分化和細胞譜系的確立，組織形成和維持，以及器官發育。由前體mRNA(pre-mRNA)(包括5'和3'剪接位點，以及外顯子和內含子的增強子或沉默序列)中的順式作用元件，反式作用因子或剪接體的其他成分突變引起的大量人類疾病進一步突顯了可變剪接的生物學重要性。組織和器官發育特別適合研究與剪接網絡識別相關的功能，細胞命運決定的調節對組織和器官功能至關重要，并且控制其從胚胎到成人的功能過渡。

然而，目前對于可變剪接的功能性影響及其機制研究仍較為有限，在體外研究可變剪接仍然缺乏直觀的檢測工具，而目前大多數研究均是對可變剪接的分析方法或與病毒、調控因子靶向調節的報告載體，并沒有可用于在細胞水平和活體水平可變剪接研究的報告載體。因此，如何提供一種能夠用于在細胞水平和活體水平檢測可變剪切事件的報告載體成為本領域技術人員亟待解決的問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種可變剪接報告載體及其制備方法，可用于細胞水平和活體水平可變剪切事件的檢測。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種可變剪接報告載體，可變剪接報告載體為在報告基因表達載體pEGFP-C1的報告基因序列內插入兩段內含子序列intron1和intron2，intron1與intron2分別具有5’剪切位點，分支位點和3’剪切位點，以保證U1snRNP可以同5’剪切位點結合從而啟動剪接，U2AF因子同分支位點和3’剪切位點之間的區域結合，使內含子得以形成套索結構發生剪接。

優選地，報告基因為EGFP基因。

優選地，intron1序列如SEQ ID NO:1所示：

GTAAATACAGAAAAAATGTTGAAATAAATAAGACTAGTACTATCTGCCTATGTGTAGAAAATCGCATTACCAACATTGTAAATGTATAAATAATGCACAATCTCAGATTTTTTTTGAATGCTAAGAAAGTCATTTACGTTCATCCACTATCTCAGTAGTAAGCTTAGGAAAATATTTAATAATGAGTTGACTGTGGGAACTAAAGTGTTTTTTTTTCTCTTTAG；

其中，下劃線部分序列依次為5’剪切位點，分支位點和3’剪切位點。

優選地，intron2序列如SEQ ID NO:2所示：