[發明專利]胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201910006602.0
• 申請日: 2019-01-03
• 公開（公告）號: CN109609471A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 馬立娟;杜麗平;肖冬光;張安琪;崔馨予;馬清
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 喻穎

一種胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g及其制備方法與應用，所述胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g來源于黑曲霉CBS513.8，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明所述的AnLPMO14g可單獨作用于纖維素類底物，對其糖苷鍵進行C1位氧化切割產生還原糖，該酶與纖維素酶協同作用，可分別提高纖維素酶降解微晶纖維素和草粉的還原糖產量。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其是涉及一種胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g及其制備方法與其應用。

背景技術

木質纖維素是地球上含量最豐富的可再生生物質資源，是生物質能源研究的熱點領域。木質纖維素生物質可以通過水解和發酵轉化為生物乙醇等生物燃料以及其他生物基產品。木質纖維素生物質的微生物轉化主要包括3個過程：預處理、酶解和發酵，其中酶解過程是決定木質纖維素生物質微生物轉化成本的關鍵步驟。木質纖維素的酶解需要多種酶的共同作用，主要包括纖維素酶，半纖維素酶、木質素酶等。但是，木質纖維素復雜的網狀結構構成了阻礙其被高效酶解的天然屏障，降低了纖維素酶和半纖維素酶的作用效率。

為了提高酶解效率，近年來，膨脹素、CBM模塊、AA9家族裂解性多糖單加氧酶(LPMO)等輔助蛋白進入了人們的視野。其中，AA9家族LPMO是最具有應用潛力的一種輔助蛋白。AA9家族多糖單加氧酶主要來源于真菌，尤其是絲狀真菌，可以借助金屬離子和還原型電子供體氧化斷裂纖維素底物的多糖鏈，為纖維素酶提供更多的結合位點，從而提高木質纖維素的降解效率。目前，已報道的AA9的來源仍然有限，開發新的來源的AA9家族多糖單加氧酶對AA9的研究以及提高木質纖維素的酶解效率有很重要的意義。黑曲霉作為一種應用廣泛的糖苷水解酶分泌型真菌，含有多個編碼AA9家族多糖單加氧酶的基因，但是目前尚未有相關研究報告，因此，黑曲霉AA9家族多糖單加氧酶具有重要研究價值。

發明內容

有鑒于此，本發明的主要目的在于提供一種胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g及其制備方法與應用。

為達到上述目的，本發明的技術方案如下：

本發明提供一種胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g，所述胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。進一步地，其來自于黑曲霉CBS513.88。

本發明還提供一種包含上述胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g的核苷酸序列的重組載體pPIC9k-An14g02670。

本發明還提供一種上述重組載體pPIC9k-An14g02670的制備方法，包括如下步驟：

S1：以黑曲霉CBS513.88的基因組DNA為模板，以上游引物和下游引物作為擴增引物，進行PCR擴增，得到胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g基因片段；

S2：用EcoR I和Not I分別對pPIC9k載體和胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g編碼基因片段進行雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切后的pPIC9k載體和胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g編碼基因片段連接，轉化，提取質粒，得到重組載體。

進一步地，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-GCGCGAATTCCACGGTCACGTCACTAACCTCGTCGT-3’；

下游引物：5’-TATATGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGAGCACTAGCAATGCACTGGTAGTAGTA-3’。

本發明還提供一種包含上述重組載體pPIC9k-An14g02670的重組畢赤酵母工程菌株GS115-AnLPMO14g。