[發明專利]胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201910006602.0
• 申請日: 2019-01-03
• 公開（公告）號: CN109609471A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 馬立娟;杜麗平;肖冬光;張安琪;崔馨予;馬清
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 喻穎

1.一種胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g，其特征在于，所述胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如權利要求1所述的胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g，其特征在于，所述胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g來自于黑曲霉CBS513.88。

3.一種包含如權利要求1或2所述的胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g的核苷酸序列的重組載體pPIC9k-An14g02670。

4.一種如權利要求3所述的重組載體pPIC9k-An14g02670的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：以黑曲霉CBS513.88的基因組DNA為模板，以上游引物和下游引物作為擴增引物，進行PCR擴增，得到胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g的編碼基因片段；

S2：用EcoR I和Not I分別對pPIC9k載體和胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g的編碼基因片段進行雙酶切，用T4DNA連接酶將酶切后的pPIC9k載體和胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g的編碼基因片段連接，轉化，提取質粒，得到重組載體。

5.如權利要求4所述的重組載體pPIC9k-An14g02670的制備方法，其特征在于，所述的上游引物和下游引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-GCGCGAATTCCACGGTCACGTCACTAACCTCGTCGT-3’；

下游引物：5’-TATATGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGAGCACTAGCAATGCACTGGTAGTAGTA-3’。

6.一種包含如權利要求3所述的重組載體pPIC9k-An14g02670的重組畢赤酵母工程菌株GS115-AnLPMO14g。

7.一種如權利要求6所述的重組畢赤酵母工程菌株GS115-AnLPMO14g的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：用BglII酶對重組載體pPIC9k-An14g02670進行線性化得到線性酶切產物；

S2：以畢赤酵母為宿主菌，將步驟S1得到的線性酶切產物轉入，經過抗性篩選陽性克隆子，獲得重組畢赤酵母工程菌株GS115-AnLPMO14g。

8.一種如權利要求1所述的胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：將如權利要求7所述的重組畢赤酵母工程菌株GS115-AnLPMO14g接種培養，并誘導其表達；

S2：收獲步驟S1的表達產物，并進行純化得到胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g。

9.如權利要求1所述的胞外AA9家族多糖單加氧酶AnLPMO14g在與纖維素酶系協同降解微晶纖維素和/或木質纖維素中的應用。